서 언
활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 생체 내 축적 되면 세포손상이 시작되어 노화와 질병을 유발시키는 주요 원 인으로, 노화와 질병을 예방하기 위해서는 생체 내 항산화 물 질을 충분히 섭취하는 것이 도움이 된다(Kim et al. 2012). 현 대인들은 성인병과 암의 예방법인 식이요법에 대한 관심이 증 가하고 있으며(Moreno et al. 2010), 암예방을 위하여 부작용 이 적은 식물의 천연물질을 이용하는 사례가 늘고 있다(Park and Kim 2014). 항산화물질은 주로 식물에 존재하며, 식용화 의 항산화물질은 과채류와 엽채류의 10배가 넘는다(Park and Kim 2014; RDA 2013), 팬지의 경우 식용화(프리뮬라, 한련화, 비올라, 금어초, 금잔화, 로즈제라늄) 중 플라보노이드 함량이 가장 높으며, 식용화 섭취빈도가 진달래, 국화, 아카시아 다음 으로 높다(Lee 2014). 플라보노이드는 고등식물과 일부 녹조 류만이 합성하여 동물에서는 합성능력이 없지만 식물에서만 존재하며, 활성산소종의 작용을 억제하고 항암성과 항돌연변 이성을 갖고 있어 여러 종류의 종양세포의 성장 및 분화를 저 해시키는 효과가 있다(Lee et al. 2001). 안토시아닌은 플라보 노이드의 색소로서 항산화, 항염증, 항암 등 다양한 생리활성 효과가 인정되고 있다(Lim and Choung 2012).
한편, 식물은 자외선 파장 영역인 280~340nm를 흡수함으 로써 free-radical scavenging activity 과정을 이용하여 세포를 보호한다(Rice-Evans et al. 1997). 그러나 조사 기간이 길어지면 식물은 시클로부탄 피리미딘 이량체(cyclobutane pyrimidine dimers: CPTH)와 같은 위험한 광 생성물 형성, 광계 Ⅱ 비활 성화, 틸라코이드막 감소, 루비스코 효소활성 감소, 클로로필, 카로티노이드 감소, 엽록체 변화, 지질의 과산화반응, IAA 광 산화, UV-B 광수용체 활성화, 안토시아닌과 플라보노이드의 축적 등의 반응을 보인다(Jansen et al. 1998). 식물에 장해를 유발하지 않고 스트레스에 대한 대응 반응을 활성화하는 자극 을 호르메시스(hormesis)라고 하는데(Shama and Alderson 2005; Choi 2011), UV hormesis는 원예산물의 품질향상의 목 적으로 활용될 수 있다(Choi 2011). 예로, 단감의 carotenoid 색소를 증가, 과피 착색 증진(Choi 2011), 오이묘와 상추의 안 토시아닌 색소 발달(Krizek et al. 1998) 등이 있다. 특히 팬지 의 경우 UV-B를 주간 20분 처리 시 플라보노이드와 안토시아 닌 함량이 증가하였으나, 30분 처리에서는 잎의 피해증상이 나타났다(Park and Kim 2014). 따라서 식물 천연물질인 항산 화물질을 증가시키면서 UV 피해가 없는 적정 처리시간을 찾 는 것이 중요하다. 본 연구는 팬지에 대한 항산화물질 증가에 효과적이었던 UV-B 20분 처리를 주·야간 처리에 따라 생장 반응과 항산화물질 변화를 알아보자 수행하였다.
재료 및 방법
식물 재료 및 처리내용
식물재료는 팬지 Viola cornuta ‘Purple’와 ‘Blue’(Viola Sorbet XpTM)을 사용하였다. 종자는 2018년 1월에 파종하여 챔버에서 주/야간 온도 25/19℃, 상대습도 60%의 환경으로 육묘하였다. 2월 초 포트(직경 7cm, 높이 8cm)에 일반 배양토(Baroker, SeoulBio, Korea, 수피 60%, 펄라이트 15%, 질석 15%, 마사토 10%)를 사용하여 이식 후 균일한 묘를 실험재료로 사용하였으 며, 챔버 내 환경은 동일하였다. 2주 후 인공재배기(Sun Garden LED home organic vegetables, Korea)를 이용하여 2주간 순 화시켰고, 처리 당 5개체씩 3반복 하였다. 실험 환경은 평균 온도 23.5±0.1℃, 평균 상대습도 34.8±0.2%였으며, 관수는 2~3일 간격으로 실시하였다. 광원은 LED(Sun Garden home grown organic vegetables white LED, Korea) 120μmol·m-2s-1 (photosynthetically active radiation, PAR)을 4시부터 20시까 지 16시간으로 하였으며, 자외선 UV-B처리는 310~320nm 부근 이 피크인 G15T8E 15W UV-B lamp (Sankyo Denki, Japan) 를 사용하여 기존 연구에서 UV-B처리 효과가 좋았던 시간인 20분을 주간(UV-D, 11:50~12:10)과 야간(UV-N, 23:50~00:10) 으로 처리하였다(Park and Kim 2014).
생장, 엽록소함량 및 엽록소 형광
팬지는 5장의 꽃잎이 완전히 핀 상태의 꽃을 5주 동안 주 2회 수확하였다. 꽃잎 무게는 암술과 수술, 꽃받침을 제외한 식용부위인 꽃잎만 측정하였고, 수확량은 수확한 꽃 무게의 평균을 내어 분당 개화수의 평균값과 곱하여 계산하였다(Park and Kim 2014). 잎의 생체중과 건물중은 신초를 제외하고 잎 몸의 길이가 1cm 이상인 잎들을 수확 5주 차에 분당 측정하 였다.
엽록소 함량은 2주 간격으로 팬지의 성엽을 chlorophyll meter(SPAD-502, Minolta Co., Japan)를 이용하여 측정하였다.
엽록소 형광(chlorophyll fluorescence)은 한 시간 암처리 후, 광계 Ⅱ에 의해 측정하였다(Yoo et al. 2012). Fluocam 800MF (Photon System Inc., Czech)를 이용하여 광도 20μmol·m-2s-1인 지점에서 quenching kinetics analysis방법으로 셔터 및 감도를 배경 광수준에 자동으로 설정하여 광화학반응의 최대 광화학적 효율(Fv/Fm)과 비광화학적 형광소멸지수(non-photochemical quenching, NPQ)를 조사하였다. 엽록소 함량과 엽록소 형광은 성엽을 측정하였다.
활성산소(Superoxide, O2-)의 NBT(Nitrotetrazolium blue chloride)염색
UV처리 후 5주차에 잎몸 1cm 이상의 잎을 채취하여 엽병 을 제거 후 0.1%(w/v) 50mM HEPES buffer(pH 7.2) 용액 안 에 넣고 암소에 시료를 4시간 침투시킨 후, 96% 에탄올에 넣 고 Water bath 70℃에서 20분간 엽록소를 제거하였다. 쿨링 후 70% 글리세롤에 저장하여 현미경 관찰을 하였다(Kumar et al. 2014).
항산화물질 변화
총 플라보이노 함량은 꽃 잎 0.1g에 75% methanol을 가하 여 암실에서 30분 추출 후 1mL를 10mL diethylene glycol과 혼합하였다(Chon and Kang 2013). NaOH 0.1mL를 혼합 후 water bath 37℃로 설정하여 1시간 동안 반응시킨 후 분광광 도계(UV 2450, Shimadzu, Co., Japan)로 흡광도 420nm에서 측정하였다. 표준물질로 naringin의 표준검량곡선을 작성하여 총 플라보노이드 함량을 % naringin equivalent로 환산하였다.
안토시아닌 함량은 꽃잎 0.1g을 99.5% 아세톤용액 10mL에 암실에서 24시간 추출 후 분광광도계를 이용하여 530nm, 653nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 Murray and Hackett (1991)의 식을 대입하여 계산하였다. 총 플라보노이드와 안토 시아닌 함량은 꽃잎 5매 중 하부 2매를 사용하였다.
통계분석
통계분석용 프로그램인 SAS package(Statistical analysis system, version 9.2, SAS Institute Inc. USA)를 이용하여 ANOVA(Analysis of variance) 분석을 실시하였으며 각 처리 간의 유의성은 DMRT(Duncan’s multiple range test) 5% 수준 으로 하였다.
결과 및 고찰
UV-B 처리에 따른 생장반응
UV처리에 따른 생장반응을 알아보기 위하여 주 2회씩 5주 간의 총 꽃의 생체중, 건물중을 조사한 결과(Table 1), 두 품 종 모두 대조구와 UV처리간 유의차는 없으나 수치적으로 UV 처리 시 낮았으며, 야간 UV처리(UV-N)가 주간 UV처리 (UV-D)보다 더 낮은 것을 알 수 있었다. 꽃수는 ‘Purple’의 경 우 수치적으로 낮아졌지만 유의적 차이는 없었고, ‘Blue’는 야 간 UV처리가 가장 낮은 것을 알 수 있었다.
5주차 엽생체중과 건물중은 처리간 유의차가 없었다(Table 1). 팬지 ‘Yellow’와 ‘Rose’에 UV-B를 20분동안 처리 시 생체 중과 건물중이 대조구와 차이가 없었던 결과와 유사하였다 (Park and Kim 2014). 그러나 UV처리 시간이 증가할수록 상 추의 잎수와 건물중 감소율은 UV-A보다 UV-B가 더 컸으며 (Krizek et al. 1998), 강낭콩에 UV-B를 3주간 주간 6시간 처 리 시 초장이 약 22% 감소하였다(Kim 2006). 즉 UV처리는 식물의 생장을 감소시키지만, 팬지 ‘Purple’과 ‘Blue’는 UV-B를 주·야간 20분 처리 시 생장감소는 없었다.
UV-B 처리에 따른 피해 양상
UV-B처리에 따른 엽의 피해증상을 알아보기 위하여 엽록 소함량을 측정한 결과(Fig. 1A, B), ‘Purple’의 경우 3주차를 제외한 1, 5주차는 처리간 유의차가 없었으며, 3주차에는 대 조구보다 주간 UV처리, 야간 UV처리 순으로 높았다. ‘Blue’의 경우 UV처리에 따른 주별, 처리별 유의차가 없었다. 20분의 UV-B처리가 식물에 피해를 주지 않은 것으로 판단된다(Kim 2004).
최대 광화학적효율인 Fv/Fm은 두 품종 모두 처리간 유의차 가 없었다(Fig. 1C, D). 건강한 고등식물의 Fv/Fm 가 0.80~ 0.83이라고 볼 때(Demmig and Klaus 1988), 모든 처리 식물 들의 Fv/Fm 수치가 0.4~0.6으로 낮은 것을 보아 실외보다 부 족한 실내 광환경의 영향인 것으로 고찰된다(Park and Kim 2014). 스트레스 지표로 사용되는 비광화학적 형광소멸지수인 NPQ는 두 품종 모두 처리간 유의차가 없었다(Fig. 1E, F).
NBT처리 후 활성산소종은 활성산소(O2-)의 발생부위는 처 리간의 경향 없이 엽병을 제거한 잎 끝 부분과 엽맥을 따라 나타났다(Fig. 2). 따라서 대조구와 비교해 보았을 떄, UV-B 처리에 따른 활성산소종 생성 차이는 나타나지 않은 것으로 보인다.
항산화물질 변화
항산화물질 섭취는 노화와 질병을 예방하는데 도움이 된다 고 알려져 있다(Kim et al. 20112). 항산화물질 중 총 플라보 노이드 함량을 분석한 결과(Fig. 3A, B), ‘Purple’은 3주차 까 지는 대조구에 비하여 주간 UV처리구가 더 많은 것을 알 수 있었다. 그러나 5주차에는 유의차가 없는 것을 알 수 있었다. ‘Blue’의 경우 3, 5주차 플라보노이드 함량이 유의차는 없지만 주·야간 UV처리가 대조구에 비해 높은 것을 알 수 있었다 (Fig. 3B). 플라보노이드 생합성 페스웨이는 UV-B에 노출 후 빠르게 up-regulate된다(Strid et al. 1994).
꽃잎의 안토시아닌 함량을 분석한 결과(Fig. 3C, D), ‘Purple’의 경우 3주차만 제외하고 야간 UV처리구가 가장 높 은 것을 알 수 있었다(Fig. 3C). 반면 ‘Blue’의 경우 처리간의 유의차가 없었다(Fig. 3D). Choi(2011)에 의하면 식물의 페놀 화합물은 자외선이 가해지면 anthocyanine 색소가 생성된다 고 하였고, 상추의 안토시아닌 증가 효과는 UV-A보다 UV-B에 서 더 높았다(Krizek et al. 1998).
결론적으로 UV-B의 주·야간 20분 처리는 팬지의 생육에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었고, ‘Purple’품종은 UV-B처 리 3주차까지 주간 20분처리가 총 Flavonoid 함량 증가에 효 과적이었다. 반면 ‘Blue’품종은 UV-B처리 효과가 없었다. 본 연구는 UV-B 주·야간 처리 시간대에 따른 팬지의 항산화물 질 함량변화를 알 수 있었으며, 생장에 영향을 주지 않았다는 점을 구명한 것에 의의가 있으며, 추후 여러 품종에 대한 연구 가 필요할 것으로 판단된다.
