서 언
난에 발생하는 바이러스는 Cymbidium mosaic virus(CymMV), Odontoglossum ringspot virus(ORSV), Tobacco mosaic virus (TMV), Orchid fleck virus(OFV), Bean yellow mosaic virus (BYMV), Tomato spotted wilt virus(TSWV), Tobacco rattle virus(TRV), Cucumber mosaic viru(CMV)(Lawson and Hsu 1995; Yamane et al. 2008; Zettler 1990) 등이 있으며, 이 가운데 CymMV와 ORSV는 다양한 난과식물 속에 가장 많이 확산되어 있다(Chang et al. 1991; Lawson and Hsu 1995; Park et al. 1998). 난과식물이 CymMV와 ORSV의 감염에 의해 나타내는 증상은 심비디움 품종에서는 줄무늬 괴사 및 줄무늬 황화증상, 호접란 품종에서는 흑색 괴사 반점 및 줄무늬 괴사 증상이 나타 나며, 카틀레야와 덴드로비움 품종에서도 괴사증상이 보고된 바 있다(Chung et al. 2010; Lawson and Hsu 1995). 또한 Orchid fleck virus 감염에 의해 심비디움 잎에 괴사 증상이 보고 된 바 있다(Kim et al. 2010). 그 외 화훼작물에 바이러스 감염으 로 인해 나타나는 괴사증상은, 국화에서 Tomato spotted wilt virus 감염에 의한 줄기 괴사 증상(Chung et al. 2006; Sherman et al., 1998; Verhoeven et al. 1996) 및 프리지아에서 Freesia sneak virus 감염에 의한 잎 괴사증상(Jeong et al. 2014)이 보고 된 바 있다. 심비디움의 경우 ORSV, 카틀레야의 경우 CymMV 감염시 꽃에 괴사증상이 나타나지만(Zettler et al. 1990), 호접란 의 경우 CMV 감염에 의한 꽃잎 탈색이 보고(Zettler et al. 1990) 되었을 뿐, 화기부분의 괴사증상은 보고된 바가 없다. 바이러스 감염에 의한 피해로 추정되는 호접란 꽃대에 괴사 증상이 나타 나면서 꽃봉오리가 말라서 떨어지는 증상이 2010년 경기도 지역 에서 상업용으로 난을 재배하는 농가에서 ‘Fireweak’ 단일품종 에서 대면적으로 발생하였다(Fig. 1). 이 품종은 중국으로부터 새롭게 도입한 품종으로 개화기에 Fig. 1의 증상을 나타내는 개체가 조금씩 나타났으며 1년 이상 증상 추이를 지켜본 결과 피해 정도가 심해지고 증상을 나타내는 그루수가 증가하였다.
따라서 본 연구는 꽃봉오리가 떨어지는 증상을 동반하는 호접란 꽃대 괴사 증상이 바이러스 감염에 의한 것인지를 확 인하고자 RT-PCR에 의한 진단 및 증상주로부터 분리된 바이 러스들의 외피단백질 염기서열 분석을 통하여 기존의 국내에 서 보고된 바이러스 분리주들과의 염기서열 및 아미노산서열 변이를 비교하였으며, 피해 증상주로부터 분리된 ORSV와 CymMV의 인공접종을 통하여 꽃대 괴저 증상이 ORSV와 CymMV 감염에 의한 것으로 확인하였다.
재료 및 방법
RNA 추출 및 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
RNA 추출은 식물체 잎 0.1g을 RNeasy mini kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 제조사의 추천 방법에 따라서 추출하여 RT-PCR 반응에 사용하였다. RT-PCR은 CymMV, ORSV, TMV, OFV, BYMV, TSWV, TRV 및 CMV를 증폭하도록 제작한 특이 프라이머를 이용하여 수행하였다. 바이러스 검출에 사용한 프 라이머 염기서열은 다음과 같았다:
CymMVK-F(5'-ACAATAATTTGAAATAATCATGGGA-3'), CymMVK-R(5'-AAAACCACACGCCTTATTAAGTTTG-3'), ORSVK-F(5'-ACGCACAATCTGATTCGTATTGAA-3'), ORSVK-R(5'-TATCAACGTTATTTTCCTAAATAT-3’), TMV-F(5'-ATGTCTTACAGTATCACTACTCC-3'), TMV-R(5'-TCAAGTTGCAGGACCAGAGG-3'), OFV-F(5'-AGGAAACATGGCTAACCCAAGTGA-3'), OFV-R(5'-CGCAGTGATGGCAAAGAGTTGCTT-3'), BYMV-F(5'-TCTGACCAAGAACAACTCAATGCA-3'), BYMV-R(5'-CTAAATACGAACACCAAGCATG-3'), TSWV-F(5'-ATGTCTAAGGTTAAGCTCAC-3'), TSWV-R(5'-TTAAGCAAGTTCTGCGAGTT-3'), TRV-F(5'-CGATGTATCTGTCAAGGAGATCAG-3'), TRV-R(5'-TTAAGTACTCCCGACCTCTAGCGA-3'), CMV-F(5'-GCTGGATG GACAAC CCGTTC-3'), CMV-R(5'-TTGATCAATTCGTTTT-3').
난으로부터 추출한 RNA로부터 상보성 DNA(cDNA) 합성을 위하여 10ng의 전체 RNA와 10pM 농도의 역방향 프라이머를 총 반응액 10μL에 넣고 70℃에서 5분 동안 반응 시킨 후 얼음 에서 4μL의 5× 역전사반응 완충액, 2.5mM MgCl2, 0.25mM 의 각 dNTP, 1μL의 Improm II 역전사효소(Promega, USA)를 넣은 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PCR 반응은, 94°C 2분 처리 후, 94°C 30초 변성, 50°C(CymMV, ORSV, TMV, CMV) 또는 57°C(OFV, TRV) 1분 결합(annealing), 72°C 1분 신장(extension) 반응을 30회 반복 반응 시킨 후, 마지막으로 72°C에서 10분 동안 연장(extension) 반응이 이루어졌다. PCR 반응액은 20μL의 cDNA, 0.2mM 각 dNTP, 2mM MgCl2, 각 10pM 농도의 역방향과 순방향 프라이머, 2.5 unit의 GoTaq DNA polymerase(Promega, USA)와 10μL의 5× PCR 완충액을 넣어 총 50μL 용액으로 조성하였다.
외피단백질 염기서열 분석
외피단백질 증폭산물은 pGEM-T easy vector(Promega, USA)를 이용하여 제조사가 제안하는 사용방법에 따라 클로닝 하였다. 염기서열 분석은 ABI P ris m BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, USA)를 이용하였 으며, 염기서열 및 아미노산 서열은 DNASTAR Lasergene version 11(Madison, WI, USA)의 CLUSTAL W 방법을 이용하 여 상동성을 비교하였다.
바이러스 인공접종에 의한 검증
‘Fireweak’ 품종에서 나타내는 꽃대 괴저 증상이 바이러스 감염에 의한 것인지를 확인하기 위하여 꽃대 괴저 증상을 나 타내는 호접란 잎에 0.05M sodium phosphate buffer(pH 7.2) 를 넣고 마쇄한 조즙액을 바이러스에 감염되지 않은 것이 확 인된 ‘Fireweak’ 품종을 포함하는 총 6품종(계통)에 품종(계통) 에 따라 18~25 그루에 접종한 후 24개월 후에 꽃대가 형성될 때 병징을 관찰하였다.
결과 및 고찰
RT-PCR 및 외피단백질 염기서열 분석
꽃봉오리 낙화를 동반하면서 꽃대 괴저증상을 나타내는 ‘Fireweak’ 품종으로부터 추출한 RNA을 사용하여 ORSV, CymMV, TMV, OFV, BYMV, TSWV, TRV 및 CMV를 증폭하 도록 제작한 특이 프라이머를 이용하여 RT-PCR 한 결과, ORSV와 CymMV 각각 716bp와 528bp의 특이 PCR 산물을 생 성하여(자료 미제공) 꽃대 괴저증상을 나타내는 호접란이 두 종류의 바이러스에 복합 감염된 것을 확인하였다. TMV, OFV, BYMV, TSWV, TRV 및 CMV 프라이머를 이용한 PCR 반응에 서는 양성대조에서만 480bp, 704bp, 822bp, 777bp, 436bp, 940bp PCR 산물을 생성하였으며 꽃대 괴저증상을 나타내는 호접란에서는 음성반응을 나타냈다(자료 미제공). 그 외 난에 발생하는 후사리움에 의한 줄기썩음병 등 원인이 될만한 곰팡 이 및 세균은 검출되지 않았다(자료 미제공).
꽃대 괴저증상을 나타내는 호접란으로부터 분리한 ORSV와 CymMV 분리주 이름을 각각 ORSV-NIHHSK2(HQ644131)과 CymMV-NIHHSK2(HQ644132)로 명명하였다. ORSV-NIHHSK2 의 외피단백질 영역 477nt는 ORSV 48개의 국내 분리주(GenBank accession no. AB541474-AB541521)와 염기서열 상동성을 비 교한 결과 98.3~100%이며 아미노산 서열 상동성은 97.5~100% 이었다(자료 미제공). CymMV-NIHHSK2의 외피단백질 영역 672nt는 52개의 CymMV 국내 분리주(GenBank accession no. AB541522-AB541573)와 염기서열 상동성을 비교한 결과 90.2~100%, 아미노산 서열 상동성은 96.0~100% 이었다(자료 미제공). 기존에 국내에서 보고된 48개의 ORSV 분리주 가운데 AB541474, AB541498, AB541504, AB541507 등 4개 분리주 만 이 총 7개의 아미노산 서열 차이를 보였을 뿐 나머지 분리주들 은 아미노산 서열이 동일하였다. 이 가운데 본 연구에서 분리 된 ORSV-NIHHSK2는 기존 국내 분리주와 3개의 아미노산 차 이를 나타냈다(Fig. 2).
바이러스 인공접종에 의한 검증
‘Fireweak’ 품종에서 나타나는 꽃대 괴저 증상이 바이러스 감염에 의한 것인지를 확인하기 위하여 조직배양을 통하여 증 식한 후 주요 바이러스에 감염되지 않은 것을 RT-PCR 방법으 로 확인한 ‘Fireweak’ 품종 및 육성계통 6종에 ORSV와 CymMV 에 복합감염된 꽃대 괴저증상을 나타내는 호접란의 잎으로부 터 추출한 조즙액을 인공접종한 후 23±3°C 유리온실에서 유지 하면서 1년 후에 꽃대가 형성될 때 육안으로 병징을 관찰하였 다. ‘Fireweak’ 품종에서 꽃이 봉오리 상태에서 노랗게 말라 죽 는 증상 및 괴저증상이 접종주 총 18 그루 가운데 2 그루에서 관찰되었으며(Fig. 3), 잎에 황색반점 및 괴저 증상을 나타냈다 (Table 1). 따라서 ‘Fireweak’ 품종의 꽃대 괴저증상 및 꽃봉오 리 고사 증상은 ORSV 또는 CymMV 단독 또는 복합감염에 의 한 것으로 추정되었으며, ‘Fireweak’ 품종은 다른 계통들에 비 해 위의 두 종 바이러스 감염에 민감한 것으로 추정되었다. 본 연구에서는 ORSV와 CymMV 복합접종을 통한 증상만을 관찰 하였으므로 추후 각각의 바이러스 단독 및 복합 접종을 통하 여 어느 바이러스가 괴저증상에 관여하는 지를 구명할 필요가 있다.
대부분의 난과식물은 기내에서 조직배양을 통해 증식되며 특히 호접란의 경우 대부분 꽃대를 배양하여 액아로부터 신초 를 유도하여 대량증식되기 때문에(Homma and Asahira 1985), 바이러스 이병주를 조직배양에 이용한 경우 바이러스에 감염 된 개체를 대량증식하게 되기 때문에 단일 품종이 동일 피해 증상을 나타낼 수 있게 된다. 국내에서도 호접란 조직배양묘 97주를 대상으로 바이러스 감염주율을 조사한 결과 CymMV 와 ORSV 단독 감염주율이 각각 8.3%와 33.5%이었으며 복합 감염주율이 45.7%로 바이러스 감염률이 높았다(Chung et al. 2010). 따라서 ‘Fireweak’ 품종의 경우도 조직배양을 이용한 대량증식 과정에서 ORSV와 CymMV에 감염된 그루를 이용하 여 바이러스에 감염된 난을 대량생산한 것으로 추정되었다. 식물체 괴저증상은 난과식물을 포함한 원예작물의 바이러스 감염에 의해 나타나는 전형적인 피해증상으로 감수성 품종의 경우 충분히 나타날 수 있는 증상이므로 호접란을 조직배양을 이용한 대량증식시에는 바이러스에 감염되지 않은 건전한 주 를 반드시 사용하여야 한다.
