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서 언

 난과식물은 단자엽 식물 중 가장 진화된 식물로 100여년 전만해도 약 750속에 17,000내지 35,000 여종이 있다고 추정되었으나, 중국이 개방되면서 새로운 난과 식물들이 소개되고 또한 오지탐험으로 인한 새로운 종들이 발견되면서 현재 880속에 21,950 내지 26,049종이 확인되고 있다(Yun and Jeong 2011). 심비디움은 한국, 일본 및 중국 등 온대지역에서 열대와 아열대 기후를 포함하는 광범위한 지역에 분포하며, 저온성으로 1-2월에 개화하는데, 꽃이 화려하고 직경 10-13cm의 대형종에서 직경 5-6cm의 소형에 이르기까지 크기와 화색이 다양하다(Yun and Jeong 2011). 또한 그 수명이 길어 전 세계적으로 인기가 높은 난과식물이다(Kim et al. 2010).

 팔레놉시스의 꽃은 우아하고 화려한 모습으로 개화기간이 길어 국내 및 해외에서 그 수요가 증가하고 있으며, 타 난과 식물과 비교하여 유묘부터 개화기까지의 기간이 짧아 농가소득이 높은 고부가가치 난과식물이다(Christenson 2001, Freed 1980). 이러한 장점으로 인해 양란류는 국내 농가의 고소득 수출화훼작목으로 인정받고 있으며(Hur et al. 2009), 그에따라 소비자의 기호도의 다양함에 의한 고품질 요구도의 증가, 난방비의 증가 및 기후변화 등으로 인해 새로운 품종의 요구도가 높아지고 있는 실정이다.

 일반적으로 난과식물에서 이러한 시대적 요구에 맞는 우수한 품종의 육종을 위하여 심비디움(Kim et al. 2006, 2008, 2010, 2012, 2013)과 팔레놉시스(Been et al. 2011, 2012; Lee et al. 2008; Park et al. 2009; Yae et al. 2012)에서 현재까지 교배육종법이 주로 사용되어 많은 성과를 올렸으나, 10년 이상 소요되는 장기간의 육종기한은 급변하는 유행과 소비자의 고품질에 대한 요구도를 맞추는데 한계가 있고(Roh et al. 2012), 동일종 내에서 새로운 품종을 개발해야 하는 한계가 있어, 유전공학 및 생명공학 기법을 적용(Lee et al. 2010)하여 종간 또는 이종 생물간 유전자를 전이, 발현 시키는 새로운 육종개념 도입을 통한 신품종 개발이 필요하다. 난에서 이러한 유전공학 및 생명공학을 도입한 식물 형질전환 연구에는 아그로박테리움 매개 기법(Chai et al. 2002; Chin et al. 2007; Hur et al. 2009; Mishiba et al. 2005; Qin et al. 2011), 유전자총(Albert et al, 2010; Liao et al. 2004; Su and Hsu 2003, 2010; Teixeira da Silva and Tanaka 2009, 2011;), 전기충격법(Griesbach and Hammond 1992; Hu et al. 1998; Nan and Kuehnle 1995), 화분관 경로법(Hsieh and Huang 1995; Nan and Kuehnle 1995)등 다양한 방법들이 사용되었는데, 본 연구에서는 이러한 식물형질전환 방법들 중 유전자총과 아그로박테리움 이 두 가지 형질전환 방법을 사용하여 심비디움과 팔레놉시스 두 난과식물에서의 형질전환 효율을 비교하고, 유전자총 전처리와 건조처리에 의한 아그로박테리움 형질전환 효율향상에 대한 효과를 알아보고자 한다.

재료 및 방법

식물재료 및 PLB 증식

 본 실험에 사용된 심비디움은 국립원예특작과학원에서 분양받은 융플라워 × 마사코계통 그리고 팔레놉시스는 부산 강산난원의 KN-02 계통을 이용하였다. 두 계통의 기내 PLB(protocorm-like bodies)를 번식한 후, 형질전환 실험에 사용하였다. PLB 증식은 PLB를 일정 크기로(가로X세로 0.5cm) 자른 후, 심비디움 증식배지인 하이포넥스 개량배지인 HCa 배지(Hyponex 3g · L^-1, trypton 1.5g · L^-1, CaNO 0.5g · L^-1, sucrose 20g · L^-1, activated charcoal 1g · L^-1)에 Plant agar 7.5g · L^-1(Duchefa, Haarlem, The Netherlands) 첨가 후, pH 5.2로 조정한 배지에 치상하여 4주마다 계대배양 실시하였다. 모든 기내배양은 24 ± 1°C, 16시간 광주기 조건 하에서 수행되었다.

유전자총 및 아그로박테리움 형질전환

 심비디움과 팔레놉시스 형질전환 과정에서 유전자총과 아그로박테리움 형질전환은 Lee et al.(2010)의 방법에 따라 수행되었는데, 유전자총 실험에 사용된 벡터는 선발유전자로 bar 유전자가 들어가고 목적유전자로 노화지연유전자(ORE7)가 포함된 pCAMBIA3301 벡터를 사용하였다. 아그로박테리움 실험에는 이 pCAMBIA3301 벡터를 AGL1 균주에 형질전환시켜 사용하였다(Fig. 1). 각각의 형질전환 조건은 우선 유전자총은 PDS-1000/He(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 장치를 이용하여, 사출거리 6cm, 1,350 psi rupture disk, 직경 1.0μm의 금입자 그리고 헬륨가스 압력 28 psi 조건에 서 수행하였고, 금입자에 유전자 코팅과정은 Roh et al.(2011)의 방법에 따라 수행하였다. 아그로박테리움은 36시간 배양하여 O.D_600nm값 0.5에 맞춘 후, 목적 PLB에 20분간 접종 후, 3일간 공동배양 기간을 거쳐 cefotaxime 500mg · L^-1 수세배지에서 2시간 동안 1차 수세 후, 다시 cefotaxime 250mg · L^-1이 포함된 2차 수세배지로 옮겨 수세과정을 마친 후, 10분간 무균작업대의 멸균여과지 위에서 건조작업을 거친 후, 유전자총 형질전환을 완료한 PLB들과 같이 형질전환체 선발약제인 제초제 PPT (Phosphinothricin) 20mg · L^-1이 첨가된 선발배지로 옮겨 주었다.

Fig. 1. Schematic map of T-DNA region of pCAMBIA3301:ORE7 vector.

유전자총 전처리 및 건조처리에 의한 형질전환 효율 증진 실험

 형질전환 효율을 증진 시키기 위하여 심비디움과 팔레놉시스를 가지고 우선 유전자 코팅을 안한 직경 1.0μm의 금입자를 이용하여 유전자총 실험을 1회 수행 후, 물리적 상처를 준 다음, 위와 동일한 아그로박테리움 접종과정을 거쳐 유전자총에 의한 상처처리가 아그로박테리움 접종 효율에 영향을 미치는지 알아보고자 수행하였다. 또한 이와 별도로 심비디움과 팔레놉시스 PLB에 0, 15, 30, 45 및 60분간 건조처리를 한 후, 아그로박테리움 형질전환을 수행하여 건조시간 차이에 따른 형질전환 효율을 비교하였다.

형질전환체 선발 및 분석 과정 (PCR 및 real-time PCR)

 PPT 20mg · L^-1에 의해 선발된 잠정적으로 형질전환 되었다고 추정되는 생존PLB들은 다음과 같은 PCR 분석을 통해 목적유전자인 노화지연유전자(ORE7)가 도입되었음을 확인하였고 아그로박테리움 유래의 형질전환 심비디움과 팔레놉시스 개체들을 대상으로 realtime PCR 분석을 다음과 같이 수행하였다. 우선 PCR 분석을 위해 잠정적인 형질전환 PLB를 채취한 후, 막자사발과 액체질소를 이용해 분쇄한 후, genomic DNA extraction kit(Real Biotech Corporation, Taiwan)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 본 실험에 사용된 노화지연유전자(ORE7; 936 bp)의 도입을 확인하기 위해 forward primer로서 5’-ATGGAAGGCGGTTACGAGCAAG-3’, 그리고 reverse primer로서 5’-TTAAAAAGGTGGTCTTGAAGGTG-3를 사용하였다. PCR 조건은 pre-denaturation은 94°C에서 4분, denaturation은 942℃에서 30초, annealing은 58°C에서 30초, extension은 72℃에서 50초로 33 cycles 그리고 last extension은 72℃에서 10분간 반응시켜 증폭반응을 수행하였다. 증폭된 DNA는 0.7% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 목표유전자의 도입여부를 확인하였다.

 Real-time PCR 분석을 위해서 qPCR 분석기기(CFX-96; Biorad, USA)를 사용하였는데 외가닥 cDNA합성은 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Toyobo, Japan)의 매뉴얼에 따라이루어졌고, 합성된 cDNA는 분광광도계(spectrophotometer; Biochrome, U.K)을 이용하여 정량하였다. PCR 분석에 필요한 cDNA의 정량오차를 줄이고 순도를 보존하기 위해 모든 cDNA샘플들은 3ng · μL^-1 농도로 희석하여 -20°C에서 사용 시까지 보관하였다. 각 반응은 3μL의 DNA(3.3ng · μL^-1), 1μL의 10배 primetime assay (4nm probe+8nm primer) 그리고 7.5μL의 Premix Ex Taq probe qPCR(Takara, Japan)으로 해서 총 15μL 용량으로 맞춰 수행하였다. PCR조건은 95°C에서 3분간 denaturation 수행하고, 95°C에서 10초씩 그리고, 60°C에서 30초간 총 40 cycles로 annealing과 extension 과정을 수행하였다. Primer는 NCBI(www.ncbl.nlm.nih.gov)에서 제공되는 온라인 프라이머 제작도구인 Primer 3를 이용해서 디자인 해서 primer time qPCR assay(IDT: Integradted DNA technology, Coralville, IOWA, USA)를 이용해서 다음과 같이 프라이머 합성 하였다. ORE7 유전자를 위해서 forward primer로 5’-ACAGCTTCAACCGCAGGGCG-3’ 그리고 reverse primer로 5’-CGTGGACGTTTTCCCGGTGCT-3’ 또한 probe 서열로 5Cy5/AGGGTCGACCCGATTCAGACCCGA/3IAbRQSp/를 사용하였다.

형질전환체 순화

 PPT 20mg · L^-1가 첨가된 선발배지에서 12주간 선발하여 생존한 잠정적 형질전환 PLB 및 기내 소식물체들은 PCR 분석을 거친 후, PPT 5mg · L^-1이 첨가된 PLB 재분화배지(HCa배지)로 이식한 후, 4주마다 계대배양 실시하여 다시 재선발 과정을 거친 후, PPT가 첨가되지 않는 일반 HCa 배지로 옮겨 발근을 유도하였다. 식물체가 5-7cm 정도 자라면 기외상태에서 1주일간 순화과정을 거친 후, 수태나 바크가 담겨있는 화분으로 옮겨 온실로 이식하였다.

결과 및 고찰

아그로박테리움과 유전자총 형질전환 효율비교

 심비디움과 팔레놉시스 형질전환에서 자주 사용되는 유전자총과 아그로박테리움 형질전환 효율을 비교하기 위해 노화지연 형질을 나타내는 ORE7 유전자가 삽입된 벡터를 이용하여 형질전환 효율비교 실험을 수행하였다. ORE7 유전자는 잎 노화를 억제하는 negative 조절자로 작용하여 애기장대에서 잎의 노화를 지연시키는 형질로 발현되어 잎의 크기를 증가시키고 꽃의 개화수 및 개화기간을 증가시킬 뿐만 아니라 biomass도 증가시키는 결과를 보여 주었다(Lim et al. 2007). 노화억제 그리고 개화기간 및 개화수의 증가 등의 형질발현 체계를 심비디움 및 팔레놉시스에서 확립하고 형질전환 식물체를 생산하기 위한 기초연구로서 본 실험을 수행하였다. 우선 일반적인 화훼류의 형질전환에 널리 사용되는 유전자총과 아그로박테리움을 이용하여 그 형질전환 효율을 비교한 결과, 심비디움에서는 아그로박테리움 형질전환방법이 평균 13%의 형질전환 효율로 유전자총을 이용한 방법의 9.5%보다 약3.5% 정도 효율이 좋았으며, 팔레놉시스에서도 아그로박테리움 형질전환 방법이 8.5%정도로서 유전자총 이용 시 나타나는 6% 형질전환 효율보다 약 2.5%정도 효율이 높았다(Fig. 2). 두 식물체 간의 비교에서는 심비디움이 아그로박테리움과 유전자총 이용 형질전환 방법 등에서 팔레놉시스 보다 각각 형질전환 효율이 3.4-4.3% 정도 높은 것으로 관찰되었다. 다른 연구자들의 사례를 비교해보면, Yang et al.(1999)의 유전자총을 이용하여 심비디움 PLBs에 GUS 및 nptII(Neomycin phosphotransferase) 유전자 도입을 위한 연구에서 약 15%의 형질전환 효율을 달성하였고, 아그로박테리움을 이용하여 PLBs에 GUS, npt II 및 hpt II(hygromycin phosphotransferase II) 유전자 도입을 위한 Chin et al. (2007)의 연구에서는 gus 유전자 발현에 의한 발색기준으로 90%의 형질전환 효율을 보여 주었다. 팔레놉시스에서 아그로박테리움을 이용하여 연구를 수행한 연구결과에서는 PLBs를 이용하여 GUS, npt II 및 hpt II 유전자 도입 시1.5-14.6%의 형질전환 효율을 나타내었고(Chai et al. 2002), protocorm을 절편체로 이용하여 GUS, npt II 및 hpt II 유전자도입 연구에서는 1.3-1.9% 효율을 보였으며(Mishiba et al. 2005), callus를 이용하여 npt 및 LTP(lipid transfer protein) 유전자를 도입한 연구에서는 9.9-12.2%의 형질전환 효율을 보여주었다(Qin et al. 2011).

Fig. 2. Comparison of two transformation methods in Cymbidium and Phalaenopsis.

아그로박테리움 형질전환 시 유전자총 전처리 효과

 DNA를 코팅하지 않은 gold 입자를 유전자총으로 심비디움과 팔레놉시스에 사출하여 상처를 낸 뒤 Agrobacterium을 접종한 결과(심비디움 1.0% 팔레놉시스 1.3%) 무처리구(심비디움 13.1%, 팔레놉시스 8.8%)에 비해 오히려 낮은 형질전환 효율을 보였다(Fig. 3). 그러나 유채의 microspores을 이용한 실험에서는 Agrobacterium만 처리한 경우 GUS 발현이 나타나지 않은 반면 아그로박테리움 접종 전에 유전자총을 이용한 상처 처리한 경우, Agrobacterium 접종 시 GUS 발현이 나타났다(Abdollahi et al. 2009). 또한심비디움 형질전환 연구보고에서는 침봉을 이용하여 상처 처리한 경우 무처리구에 비해 2배 이상 높은 형질전환 효율을 보였으며 (Lee 2010), 팔레놉시스(Hur et al. 2009)에서는 철제침에 Agrobacterium 현탁액을 묻혀 dipping 처리한 결과 dipping 처리된 부위에서 새롭게 생성되는 PLB의 GUS 염색이 강하게 나타났다. Chai et al. (2002)의 연구에서 팔레놉시스 PLBs의 표층을 벗겨 아그로박테리움을 접종한 경우(8.4%) 세포의 손상을 야기 하여 침봉을 처리한 경우(16.2%)에 비해 낮은 형질전환 효율을 보였다. 본 연구에서 유전자총 처리시 아그로박테리움 형질전환의 효율이 저하된 것은 Chai et al. (2002)의 결과와 마찬가지로 유전자총처리가 세포에 물리적 충격을 가해 세포의 손상을 야기하였기 때문으로 판단된다. 따라서 유전자총 대신 초음파(Liu et al. 2005; Zhao et al. 2003) 또는 진공 처리(Liu et al. 2005; Ye et al. 1999) 삼투압 조절제 처리(Cheng et al. 2004; Hiei et al. 1994)등 다른 처리를 통하여 아그로박테리움 형질전환 효율 향상에 대한 연구가 필요하다고 판단된다.

Fig. 3. Effect of wounding treatment using particle bombardment before Agrobacterium infection on transformation efficiency in Cymbidium and Phalaenopsis (Control: Agrobacterium infection without particle bombardment).

건조처리에 의한 아그로박테리움 형질전환 효과

 본 실험에서는 Agrobacterium 접종 전 건조처리가 형질전환에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 무균작업대에서 0, 15, 30, 45, 60분간 건조 처리한 결과 심비디움에서 45분 처리 시 19.6%, 팔레놉시스에서는 60분 처리 시 12.6%로 가장 높은 형질전환 효율을 얻었으며 무처리구와 비교하여 각각 2.1배, 1.3배의 높은 형질전환 효율을 보였다(Fig. 4). Cheng et al. (2003) 은 Agrobacterium 접종 전 5-60분의 건조처리 시 T-DNA의 전이가 증가한다고 보고하였다. 사탕수수 캘러스(Arencibia et al. 1998)에서 callus를 0, 15, 30, 45, 60분간 건조처리 후 GUS 검정을 통하여 형질전환율을 조사한 결과 30분 처리 시 가장 높은 효율을 보였으나 1시간 이상 처리 시에는 건조 피해가 발생하였다. 또한 벼 캘러스(Urushibara et al. 2001)의 경우 건조처리구(8.5-15.4%)에서 무처리구(0.3-1.2%) 보다 10배 이상 형질전환 효율이 증가하였다.

Fig. 4. Effects of drying treatment before Agrobacterium infection on transformation efficiency in Cymbidium and Phalaenopsis.

형질전환체의 유전자 검정 및 증식 후 순화과정

 아그로박테리움 및 유전자총을 이용하여 생산한 형질전환 심비디움과 팔레놉시스 개체들은 형질전환 직후 PPT(phoshinoyhricin: 선발용제초제)가 20mg · L^-1 첨가된 선발배지에서 4주간의 계대배양간격을 가지고 8주에서 12주간 선발과정을 거쳤다. 이 중 선발배지에서 생육이 우수한 PLB를 선별하여 신초가 2-5cm정도에 도달하면, PCR 분석을 실시하였다. 이렇게 생산된 형질전환 개체들중 7계통을 임의로 선발하여 PCR분석을 실시한 결과, 936bp 크기의 노화지연유전자(ORE7)가 도입되었음이 확인되었다(Fig. 5A). 또한 도입된 ORE7 유전자의 copy수를 확인하기 위해 형질전환 되었다고 판단되는 양란식물체 중24계통을 임의로 선발하여 real-time PCR을 수행하였다(Fig. 5B). 1번부터 15번이 심비디움 형질전환체이고, 16번부터 24번이 팔레놉시스 형질전환 계통으로 심비디움 15계통 중 8계통이 1 copy 삽입개체였고, 6계통이 2 copies 그리고 1 계통이 3 copies임을 보여주었다. 반면 팔레놉시스는 6계통이 2 copies, 2 계통이 3 copies 그리고 1 계통이 1 copy임을 나타내었다(Fig. 5B). 이 결과를 통해 팔레놉시스와 심비디움 모두 아그로박테리움 형질전환 방법에서 유전자총을 이용한 경우보다 좀더 안정적으로 유전자가 도입되었고, 향후 노화지연유전자의 기능성검정 에서도 안정적으로 발현되리라 기대된다. 유전자총을 이용한 형질전환 방법은 톨페스큐(Gao et al. 2008), 보리(Travella et al. 2005)등에서 아그로박테리움보다 적은 안정성과 낮은 효율로 유전자가 삽입된다는 보고들이 있어 본 실험에서는 아그로박테리움 유래형질전환 양란식물체를 대상으로 real-time PCR 검정을 수행하였다.

Fig. 5. Molecular analysis of transgenic Cymbidium and Phalaenopsis plants by PCR and real-time PCR analysis (A: PCR analysis-ORE gene product size 936 bp, NC: non-transformed plants, #1-#7: transgenic Cymbidium plants, B: real time PCR analysis, #1-#15: transgenic Cymbidium plants; #16-#24: transgenic Phalaenopsis plants).

 본 연구에서 생산된 형질전환 식물체는 기내 배양 중인 비디움이 약 100여 개체, 팔레놉시스가 45개체 정도 이며, 증식 후 순화과정을 거친 개체는 심비디움 9계통 35개체 그리고 팔레놉시스 4계통 24개체가 생육중에 있다(Fig. 6).본 연구에서 생산된 형질전환 식물체는 기내 배양 중인 비디움이약 100여 개체, 팔레놉시스가 45개체 정도 이며, 증식 후 순화과 정을 거친 개체는 심비디움 9계통 35개체 그리고 팔레놉시스 4계통 24개체가 생육중에 있다(Fig. 6). 

Fig. 6. General process of the production of transgenic Cymbidium (AC) and Phalaenopsis plants (D-F).

 결론적으로 심비디움과 팔레놉시스에 아그로박테리움과 유전자총을 이용하여 형질전환 실험을 수행한 결과 아그로박테리움 매개법에서 유전자총 보다 2.5-3.5% 더 높은 형질전환 효율을 얻었고, 아그로 테리움 접종 전 유전자가 코팅 되지 않은 골드 입자를 이용한 유전자총 처리는 7.5-12.1% 낮은 효율을 보였으며, 아그로박테리움 처리전 건조 처리는 팔레놉시스에서는 60분(12.6%), 심비디움에서는 45분(19.6%) 처리가 가장 효과적으로 나타났다. 상기 결과들을 적용해서 획득한 심비디움 및 팔레놉시스 형질전환체는 형질전환체는 PCR 및 real-time PCR 을 이용하여 도입을 확인 하였으며 선발과정을 거쳐 형질전환체 증식 및 순화 과정 중에 있다.

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 본 연구는 농촌진흥청 공동연구사업(과제번호: PJ00929608-2013)의 지원에 의해 수행되었음.