서 언
장미과는 3가지 아과를 포함해 3000종이 속한 큰 규모의 분류군 중 하나이다(Xiang et al. 2017). 장미과 식물은 꽃과 과일이 아름다운 대표적인 관상 식물로 경제적, 원예적 가치가 높아 널리 활용되고 있다. 장미과는 초목, 관목, 교목 등 다양한 형태로 자라기 때문에 정원, 화단, 실내 장식, 절화 등 여러 방면으로 활용되며, 수 많은 품종이 육성 및 재배되고 있다(Li et al. 2021). 자생식물을 이용한 관상식물은 환경 조건에 대한 적응성이 뛰어난 것이 장점인데 그 중 Rosa gallica, R. pimpinellifolia, R. villosa는 생울타리로 이용되고 Pontentilla alba는 꽃 수가 많고 아름다운 잎의 모양으로 인해 관상가치가 높으며 P. anserina는 수변공원의 조경식물로 사용하기 탁월하다. 이와 같이 장미과 자생식물은 관상 및 조경용으로 이용하기 유리한 조건을 가지고 있다(Tofan-Dorofeev 2018).
뱀딸기속(Duchesnea)은 장미과(Rosaceae)에 속하는 분류군으로 서식지는 아프가니스탄에서 인도, 말레이시아, 중국을 거쳐 한국, 일본, 대만, 필리핀까지 이른다(Naruhashi and Iwatsubo 1991). 한반도에 뱀딸기속 식물은 뱀딸기(Duchesnea indica)와 산뱀딸기(D. chrysanth) 2종이 서식한다(Heo et al. 2019). 동아시아 및 서아시아가 원산인 뱀딸기는 아시아뿐만 아니라 세계 전역으로 퍼져 유럽 북미 등 여러 지역에서 자생하는 것으로 보고되었다(Debes et al. 2011;Littschwager et al. 2010;Naohiro and Mamoru 1996). 뱀딸기는 여러해살이풀로 4~5월에 노란색 꽃을 피우며 개활지나 도로 및 산림 가장자리 등 광량이 충분한 곳에서 주로 자생한다(Naohiro and Mamoru 1996). 뱀딸기와 산뱀딸기의 생약명은 사매(蛇 莓)라 일컬으며 소염, 해독, 청혈, 지혈, 항종양, 외과창상, 산결, 진해 작용을 하는 것으로 알려져 있다(Lee et al. 1987, 1988). 산뱀딸기의 추출물이나 뱀딸기 파우더에 함유된 여러 항산화성분들을 통해 활성산소종이 효과적으로 소거되어 산화적 손상을 완화할 수 있으며(Song and Choi 2018), 뱀딸기의 추출물이 염증성 사이토카인을 억제할 수 있는 원리로 항염증 효능이 입증되었다(Ullah et al. 2021;Yang et al. 2008). 뱀딸기의 페놀성 추출물이 세포사멸 유도 및 세포분열 진행을 중단시켜 난소암세포의 증식을 유의적으로 억제하는 등 항암, 생리적 활성 기능과 항산화, 면역조절에 대한 연구가 활발하게 보고되고 있기 때문에 뱀딸기는 약용 작물로써 이용 가치가 매우 높다 (Kim et al. 2007;Peng et al. 2009;Zhu et al. 2015).
종자휴면은 유묘가 생육하기 적절한 환경에서 발아하고 유묘가 생존하기 힘든 환경에선 발아를 방지하는 메커니즘으로 식물의 생활사에 매우 중요한 특성이다(Allen and Meyer 1998). 종자가 발아할 수 있는 적절한 환경조건에서 일정 기간내에 발아하지 않으면 휴면상태로 판단한다(Baskin and Baskin 2004). 종자휴면유형은 총 5가지로 분류할 수 있는데, 생리적인 요인으로 발생하는 생리적휴면(Physiological dormancy, PD), 미성숙된 배로 인해 배가 성숙한 후에 발아하는 형태적휴면(Morphological dormancy, MD), 형태적휴면과 더불어 생리적휴면 특성을 가진 형태생리적휴면(Morphophysiological dormancy, MPD), 종피의 불투수성으로 휴면이 발생하는 물리적휴면(Physical dormancy, PY), 물리적 휴면과 동시에 생리적 휴면을 가진 조합휴면(Combinational dormancy, PY+PD)등으로 분류한다(Baskin and Baskin 2004). 일본에서 자생하는 뱀딸기와 산뱀딸기 종자를 25/17°C[Day(12h)/Night(12h)]조건에서 배양하였는데, 뱀딸기는 배양 30일 만에 90%, 산뱀딸기는 70% 이상의 발아율이 나타났다(Naohiro and Mamoru 1996). 동부 티베트 고원에서 자생하는 뱀딸기 종자를 4°C에서 40일이상 건조상태로 저장한 후 20/5°C조건에서 배양하였을 때 2%가 발아하였으나 3°C에서 저온습윤상태에서 저장한 후에 배양한 처리구에선 73%가 발아하였다(Liu et al. 2011). Baskin and Baskin(2014)은 Liu et al.(2011)의 저온처리 후 발아율이 증가한 실험결과를 근거로 뱀딸기의 종자휴면유형을 생리적휴면(PD)으로 분류하였다. 일본에서 자생하는 뱀딸기는 휴면 타파처리 없이 30일 이내에 70% 이상 발아한 반면에 (Naohiro and Mamoru 1996), 티베트에서 자생하는 종자는 휴면 타파처리가 필요하였다(Liu et al. 2011). 이처럼 지역에 따라 종자휴면이 달라지는 경향이 나타나 이번 연구 결과를 바탕으로 한반도에 자생하는 뱀딸기와의 종자휴면유형을 비교하였다.
본 연구는 약용 및 관상식물로 이용가치가 높은 뱀딸기의 효율적인 증식 방법에 대한 기초자료를 확립하고자 종자발아특성을 조사하였다.
재료 및 방법
실험재료
본 실험에 사용한 뱀딸기 종자는 2021년 7월 충청남도 예산군 가야산에서 채종하였다. 종자의 길이, 너비를 버니어켈리퍼스로 측정하였으며 외부형태는 육안관찰 하였다. 종자의 내부 형태를 관찰하기 위해 면도칼(Stainless blade, Dorco, Seoul, Korea)로 종자를 절개하여 그 단면을 USB현미경(AM4515T Dino-Lite premier, AnMo Electrionics Co., New Taipei City, Taiwan)을 이용해 촬영하였으며 종자의 배가 미숙배인지 판단하기 위해 Embryo:Seed ratio를 조사하였다.
수분흡수 실험
물리적 휴면의 유무를 확인하기 위하여 수분흡수율을 조사하였다. 20립 3반복으로 상온(22~26°C)의 환경에서 종자에 수분이 흡수되도록 증류수를 공급하였다. 90×15mm petri dish에 여과지(ADVENTEC No. 1) 2매를 깔고 그 위에 종자를 치상하였다. 종자에 수분이 흡수되기 전 무게와 침지 시작 후 3, 6, 9, 12, 24시간이 지났을 때 무게를 측정하였다. 수분흡수율 계산식은 다음과 같다.
%Ws = [(Wh-Wi)/Wi]×100
Ws = 건조종자의 무게 대비 증가된 종자의 무게, Wh = 수분 흡수 후 증가한 종자의 무게, Wi = 초기 종자의 무게
온도조건 별 발아 실험
뱀딸기 종자의 발아 적온을 찾기 위해 종자는 살균제(Benomyl, FarmHannong, Seoul, Korea) 500mg·L-1에 24시간 침지하여 소독한 뒤 증류수로 3회 수세한 후 여러 온도 조건[(5, 15, 20, 25, 15/6, 20/10, 25/15°C)Day/Night]에 배양하였다. 35립 3반복으로 설정하여 8주 동안 일주일마다 발아율을 조사하였다.
Move-along test
계절에 따른 온도변화에서 나타나는 종자 발아 반응을 확인하기 위해 종자배양 온도 체계를 통해 인공적으로 계절이 변화하는 환경을 조성하여 발아율을 조사하였다. 온도조건 별 발아 실험과 동일한 조건으로 종자를 소독한 후 온도 체계를 T1(25/15°C 12주→20/10°C 4주→15/6°C 4주→5°C 12주)과 T2(5°C 12주→15/6°C 4주→20/10°C 4주→ 25/15°C 12 주)]로 나누어 배양하였다. 35립 3반복으로 치상하여 일주일마다 조사하여 32주차까지 발아율을 조사하였다.
GA3 처리에 의한 효과
GA3 처리로 인한 휴면 타파 효과가 있는지 확인하기 위해 실험을 실시하였다. 종자를 각각 0, 10, 100, 1000mg·L-1의 GA3 용액에 24시간 동안 침지하여 처리한 후 살균제 500mg·L-1에 24시간 침지하여 소독한 뒤 증류수로 3회 수세한 뒤 25/15°C 조건의 생장상에서 배양하여 발아율을 조사하였다.
통계처리
본 실험으로 조사된 데이터는 SAS 9.4(SAS institute Inc., Cary, USA)을 이용하여 분산분석(anova)을 실시하였고, 각 처리간 평균의 통계 유의성은 Tukey’s honestly significant difference test(p<0.05)를 사용하였다. 그래프는 Sigma Plot v10.0(Systat Software Inc., California, USA)을 이용하여 작성하였다.
결 과
뱀딸기 종자 외부 크기는 대략 1mm이며 옅은 황색의 딱딱한 종피를 지녔다(Fig. 1). 종자 길이는 1.13±0.03mm, 너비는 0.7±0.03mm로 나타났으며 배와 종자 길이의 비율을 의미하는 E:S ratio(Embryo:seed ratio)는 0.926±0.008로 나타나 배가 종자의 상당 면적을 차지하는 것으로 확인하였다(Fig. 1).
뱀딸기 종자의 수분흡수 테스트 결과, 침지 3시간만에 종자 초기무게 대비 100% 이상 증가하여 108%로 나타났고, 침지 24시간까지 계속 증가하여 176%로 나타났다(Fig. 2).
뱀딸기 종자를 여러 온도조건에서 배양한 결과, 모든 온도조건에서 배양 5주차 이내에 발아하기 시작하였고, 25/15, 20/10, 15/6, 5°C에서 각각의 최종발아율은 88, 71, 61, 12%로 나타났으며 25, 20 ,15°C에서는 각각 89, 39, 17%로 나타났다. 25/15°C와 25°C의 상대적 고온에서의 최종발아율은 각각 약 90%로 나타났으며 15/6, 5, 15, 20°C의 상대적 저온에서는 약 40%이하로 나타났다(Fig. 3).
Move-along test 결과, T1의 25/15°C구간에서 배양 6주차에 점차 발아하기 시작하여 12주차에 최종발아율에 도달해 72%의 발아율이 나타난 반면에, T2에선 5°C 12주→15/6°C 4주→20/10°C 4주 동안엔 전혀 발아하지 않았다(Fig. 4). T2의 27주차인 25/15°C로 이동된 후 7주차부터 발아하기 시작하여 최종발아율은 16%로 나타났다(Fig. 4).
GA3처리구에선 배양 3주차에 발아를 시작한 반면에 대조구에선 배양 4주차부터 발아하였다(Fig. 5). 총 8주 동안 배양했으며 GA3 0, 10, 100, 1000mg·L-1 처리구의 최종 발아율은 각각 89, 91, 87, 96%로 1000mg·L-1처리구에서 다른 처리 보다 유의적으로 높았다(Fig. 5).
고 찰
Martin(1946)은 장미과 종자의 내부 형태를 Bent 혹은 Investing 형태의 배에 부드러운 질감의 배유를 가지며 뱀딸기 종자는 Investing 형태를 띄는 것으로 서술하였다. 본 연구에서 확인한 뱀딸기 종자는 배유보다 배가 상대적으로 크고 종자 중앙에 위치해 Martin(1946)이 보고한 종자 내부형태와 일치하는 것을 확인하였다(Fig. 1). 유근이 돌출하였을 때 배의 길이 신장은 없었다. 종자가 완전히 성숙한 상태에서 배가 작고 미숙할 경우 형태적휴면(MD)으로 분류하는데(Baskin and Baskin 2004), 뱀딸기 종자의 배는 크고 성숙한 상태이므로 형태적휴면 (MD)에 해당하지 않는다(Fig. 1).
종피나 과피의 불투수성으로 인해 종자내부로의 수분 침투가 억제되는 휴면유형은 물리적휴면(PY)로 분류하는데(Baskin et al. 2000), 종자의 수분침지 전 무게대비 침지 후 무게가 24시간 이내에 20%이상 증가할 경우 종피에 투수성이 있다고 판단한 다(Baskin and Baskin 2003). 따라서 뱀딸기 종자는 종피에 투수성이 있기 때문에 물리적휴면(PY)는 없는 것으로 판단하였다(Fig. 2).
온도 별 발아 실험 결과, 25°C와 25/15°C의 4주차 발아율은 40% 이하로 나타났으며 배양 7주, 8주차에 최종발아율에 도달하였다(Fig. 3). 종자가 적절한 환경조건에서 4주 이상 발아하지 않을 경우, 휴면상태인 것으로 판단한다(Baskin and Baskin 2004). GA3처리 실험에서는 배양 3주차에 처리구들은 발아한 상태였으나 대조구에선 발아한 종자가 없으며 최종발아율 또한 GA3 1000mg·L-1에서 다른 처리구들 보다 높게 나타나 GA3에 발아를 촉진하는 효과가 있는 것으로 나타났다(Fig. 5). 이는 Baskin and Baskin(2004)의 종자휴면 유형을 판단하는 방법에 따라 뱀딸기 종자가 생리적휴면(PD)으로 분류할 수 있다. 한반도 자생 뱀딸기 종자는 PD로 판단된다. 25/15의 4주차 발아율에 의해 뱀딸기 종자의 27%는 Non dormancy(ND)이고, 약 73%가 PD로 판단된다(Fig. 3). Move along test 결과, 5°C 12주→15/6°C 4주→20/10°C 4주 동안 발아하지 않았다가 25/15°C의 고온에 노출되어 발아하였다. 수분을 흡수하고 휴면이 타파된 종자는 유묘의 생육이 불리한 조건에서 2차휴면에 돌입할 수 있다(Finkelstein et al. 2008). 이는 ‘Brassica napus 종자의 경우 일정한 온도와 삽투압 스트레스를 통해 2차 휴면에 돌입할 수 있다(Momoh et al. 2002)’는 연구결과와도 일치한다. 따라서, 온도 별 발아 실험 결과에서 각각 환경조건은 발아하기 충분한 조건으로 나타났지만, T2의 26주간 발아하지 않은 이유는 온도 처리 단계의 환경스트레스에 의해 2차휴면이 유발되어 발아가 지연된 것으로 판단된다(Fig. 4).
동부 티베트 고원에서 자생하는 뱀딸기 종자를 40일 이상 각각 4°C에서 건조 처리와 3°C에서 저온습윤 처리 후 20/5°C 에서 배양하여 발아율을 조사하였는데, 각각 2, 73%로 나타나 PD로 분류하였다(Baskin and Baskin 2014;Liu et al. 2011). 일본에서 자생하는 뱀딸기와 산뱀딸기 종자는 25/17°C 에서 배양 30일 만에 70% 이상 발아하였다(Naohiro and Mamoru 1996). 지질학적으로 이동함에 따라 같은 계통의 식물의 분류군 내에서 생리, 생태학적 특성이 변화하지 않거나 (trait stasis) 변화하는데(adaptation), 휴면타파 및 발아 특성은 긴 시간이 흘러 진화해 온 생리학적 메커니즘뿐만 아니라 생태적 특성을 나타낸다(Adams et al. 2007). 계통발생학적으로 Potentilla속은 Duchesnea속과 함께 Potentillaea족에 해당하며 같은 분계군(Clade)으로 분류한 것으로 보고되어 장미과 내의 다른 속 보다 서로 근연관계로 사료된다(Eriksson et al. 2022). 따라서 Potentilla속 식물의 종자 발아 및 휴면을 비교 분석하였다. 미국 켄터키 주에서 자생하는 P. recta는 15/6°C조건에서 15일간 배양하였을 때, 발아율이 10% 미만으로 나타났는데, 한달간 노천매장 후 15/6°C조건에서 15일간 배양하였을 때, 약 60%의 발아율이 나타나 PD로 분류되었다 (Baskin and Baskin 1990, 2004). 오스트리아 알프스 협곡에서 수집된 P. aurea와 P. frigida는 25/10°C조건에서 60일간 배양하여 각각 4, 0% 발아하였고, 저온습윤처리 후 각각 23.4, 1%의 발아율이 나타나 Deep-PD로 분류되었다(Schwienbacher et al. 2011). 러시아 캄차카 반도의 Volcanic complex에서 수집된 P. vucanicola는 22~28°C조건에서 30일 이내에 40% 이상 발아하지 않아 2°C의 저온에서 30일 이상의 저온처리 후 배양 13일차에 25% 이상 발아하였고, 최종발아율은 52%로 나타나 PD로 분류되었다(Baskin and Baskin; Voronkova et al. 2011). 일본 북해도의 다이세츠산맥에서 자생하는 P. matsumurae종자는 35/25, 20/30, 15/25, 20/10, 15/5°C에서 40일간 배양한 후 발아율이 각각 97, 99, 58, 31, 0%로 나타나 ND로 판단된다 (Shimono and Kudo 2003). 동부 티베트 고원에서 자생하는 P. tanacetifolia 종자는 25°C에서 19일간 배양하여 약 70%가 발아하여 ND로 판단된다(Liu et al. 2011). 티베트에 자생하는 뱀딸기는 PD(Liu et al. 2011), 일본에서 자생하는 뱀딸기는 ND로 나타났고(Naohiro and Mamoru 1996), 전 세계에 분포하는 Potentilla속 식물 중 3종이 PD(Baskin and Baskin 1990, 2004;Schwienbacher et al. 2011;Voronkova et al. 2011), 2종이 ND로 조사되었다(Liu et al. 2011;Shimono and Kudo 2003). Potentilla속은 신생대 중 고진기에 칭하이 및 티베트 고원에서 발생해 신진기에 다른 지역으로 퍼져나갔으며 지구 온도가 급격히 감소했던 신진기의 후기 플리오세때 모든 생물지리적 지역으로 종 다양성이 높아졌다(Xue et al. 2024). Potentillaea족 식물은 일본으로 이동하면서 환경에 적응함에 따라 종자휴면 유형은 ND로 변화하는 환경적응이 나타났고, 티베트, 러시아, 미국 지역과 한반도에서는 PD로 나타나 Potentilla 속 식물과 뱀딸기는 환경에 대한 적응 과정에서 PD를 유지하는 경향인 trait stasis 나타내는 것으로 판단된다. 종자 휴면의 분화는 종 분화율과 계통의 다양성을 근거로 형태생리적 휴면이 가장 조상격인 휴면유형이고 다른 휴면 유형은 ‘evolutionary hub’로 기능한 생리적휴면으로부터 분화된 것으로 밝혔다. 또한, 다른 휴면 유형에서 ND로 진화할 수 있으나 PD에서 진화했을 가능성이 가장 높고 일반적인 것으로 나타났다(Willis et al. 2012). 한반도 자생 뱀딸기 종자는 휴면타파 처리없이 20/10°C 에서 배양 6주 이내에 60% 이상 발아하였지만(Fig. 3), 티베트에서 자생하는 뱀딸기 종자는 20/5°C조건에서 6주 이내에 약 2%가 발아하였다(Liu et al. 2011). 따라서, 티베트 자생 뱀딸기 보다 한반도 자생 뱀딸기가 생리적 휴면의 깊이가 낮다고 판단할 수 있다. 일본의 뱀딸기는 ND로 나타났기 때문에 (Naohiro and Mamoru 1996), Potentilla속의 기원인 칭하이 및 티베트 고원 지역에서 발생된 뱀딸기는 한반도를 거쳐 일본으로 이동하는데 생리적 휴면의 깊이가 낮아지는 방향으로 진화 하였을 것으로 추측된다. 그러나 보다 정확히 증명하기 위해 티베트, 한반도, 일본에 자생하는 뱀딸기의 추가적인 계통지리 학적 검증이 필요하다.