서 언

장미는 Rosaceae과 Rosa 속 식물로 전세계에서 가장 인기 있는 관상용 식물 중 하나이며, 북반구 온대 및 아열대 서식지 전체에 분포하며 약 250개의 종과 30,000여 품종이 존재한다 (Guan et al. 2024;Ismonova et al. 2024). 다양한 장미 속 식물을 체계적으로 관리 및 분류하여 이용하기 위해 분류학자 Rehder는 Hulthemia, Rosa, Platyrhodon, Hesperhodos 4개의 아속(subgenus)으로 분류했다(Tomljenović and Pejić 2018). 전남대학교 화훼원예학실험실은 장미 육종 연구 활성화를 위해 20년간 장미 유전자원의 수집, 증식 및 특성평가를 통해 장미 속 유전자원을 해당화, 정원 장미 등 13종으로 분류했다 (Choi et al. 2018). 하지만 장미의 분류에 있어 장미 유전자원을 동일한 환경 조건에서 생육하기 어려워 환경 변이 및 주관적 판단에 의해 분류하여 객관적인 결과를 도출하기에 한계가 있고 (Chettri et al. 2024), 육종 계통, 잡종 및 품종 식별 확인에 있어 형태적 특징만으로 구별하는 것이 어려워 정확한 분류 및 평가를 위해 다양한 분자 표지가 개발되었다(Smulders et al. 2009).

Rosa 속에서는 Simple Sequence Repeats(SSR), Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD) 및 Inter Simple Sequence Repeats(ISSR)과 같은 분자 마커를 활용한 유전적 특성 분석 기술이 연구되어 분류에 적용되었다(Akond et al. 2012;Panwar et al. 2015). 이를 바탕으로 환경의 영향이 최소화되는 UPOV 형질 데이터와 RAPD markers 데이터 결과를 비교분석하여 품종의 다양성 연구 및 품종별 분류군이 확인 되었으며(Kim et al. 2011b), 형태학적 및 분자학적 분석을 이용해 standard, miniature, 그리고 야생 자원 내 유전적 변이평가 및 현대장미와 야생종의 분류가 실시되었다(Kim et al. 2011a). 분자학적 분석 방법 중 SSR markers를 이용한 분석은 장미 사이의 유전적 다양성과 관계를 설명하는 데 유용하여 관련된 종 사이에 있어 품종 식별이 가능한 정보를 제공할 수 있으며, 장미 유전 및 개체군 분석 등에 널리 이용된다(Amrapali et al. 2024). 또한, 다수의 대립유전자를 검출할 수 있으며 밀접하게 관련된 개체를 구별할 수 있고 잡종 확인이 용이한 SSR markers 는 장미 분류에 적극 활용되고 있다(Babaei et al. 2007).

다양하게 분류되는 장미 속 자원을 이용한 현대 정원장미 육종은 1867년 프랑스 육종가 Guillot에 의해 시작되어 지금까지 약 150년의 역사를 가지고 있다(Nolan 2019). 주요 장미 육종 회사는 영국의 David Austin, 프랑스의 Meilland, 독일의 Rosen Tantau 등이 있으며 회사별 특색있는 육종 방향성을 설정하여 품종을 개발해 오고 있다(KATI 2019). 지금까지 육성된 장미 품종은 병해충 저항성과 환경 적응성 및 관리 용이성 등의 특성을 지닌 개체로, 이러한 특성을 바탕으로 경쟁력 있는 품종 개발에 야생장미 10여종 내외가 활용되었다(Joung et al. 2010). 현재 국내 자생 장미는 총 13종으로 확인되고 있으며 (KNA 2022), 이들 가운데 해당화는 병충해에 대한 저항성과 내한성 및 내염성이 있어 척박한 환경에도 잘 적응하는 특징이 있다(Bruun 2005;Zang et al. 2021). 이러한 이유로 해당화는 한국 정원 장미 개발에 이용되기 아주 적합한 자원으로써 생각되지만, 시장성 높은 정원 장미 개발을 위한 자원의 특성·유전적 다양성 평가 및 육종 활용에 관한 연구는 드물다. 경쟁력 높은 정원 장미 품종 국내 육성을 위해 정확한 분류를 통한 육종적 가치가 있는 잠재된 자원을 발굴하고 국내 환경 적응성이 높은 국내 자생 장미 속 자원의 지속적인 가치 평가가 필요하다.

이에, 본 연구는 세분화된 장미의 형태학적 특성을 이용한 형질 분석을 실시함과 더불어 객관적인 평가가 이루어질 수 있도록 SSR markers를 이용한 분자학적 분석을 실시해 활용성 높은 형질과 육종 재료를 선발하고자 하며, 선발된 자원의 교배 적합성을 테스트하여 국내 자생 해당화의 육종적 활용을 증대시키고자 수행되었다.

재료 및 방법

식물 재료

장미 속 자원 간 형태학적 특성 평가를 실시하기 위해 광주광 역시에 위치한 전남대학교 교내실습장과 전라남도 나주시 봉황면에 위치한 전남대학교 나주실습장에 식재된 장미 속 자원 303점을 활용하였다(Appendix 1). 유전적 다양성 평가를 위해 해 당화 및 장미 속 자원 303개 중 Rosa 아속의 Cinnamomeae절에 해당하는 자원 18점, Caninae절 자원 1점, Synstylae절 자원 3점, Indicae절 자원 1점과 Platyrhodon 아속에 속하는 자원 1점, Old garden roses 자원 1점, Modern garden roses 자원 3점, Rosa sp. 자원 1점 총 29점을 형태학적 분석 및 분자 학적 분석에 활용하였다(Appendix 2, 3, 4). 해당화 및 장미 속 자원 간 교배 적합성 평가를 위해 Rosa rugosa 종에 해당하는 RRU603, JNR1475, JNR1480 3점과 장미 속에 해당하는 R. rugosa x R. arvensis R090145, R. sp. JNR1470, R. hybrida ‘Garden Peace’ 3점 총 6점을 사용하였다.

형태학적 특성 평가

형태학적 특성 평가는 2023년 4월~11월 국립종자원 장미 특성조사요령(KSVS 2008)을 기반으로 실시하였으며 병충해 저항성 및 연속개화성 등의 30개 항목을 추가하여 총 81가지 항목에 대한 형질 조사를 실시하였다(Appendix 5).

DNA 추출 및 증폭

해당화 및 장미 속 자원 간 유전적 다양성 평가 실험에 사용된 29가지 자원의 유연관계 파악을 위해 각 자원의 신초를 채취하여 gDNA를 추출하였다. DNA 추출은 HiGene^TM Genomic DNA Prep Kit for Plant(GD263-060, Solgent, Korea)를 이용해 매뉴얼에 따라 추출하였다. 추출한 gDNA는 1.6% agarose gel에서 전기영동 후, UV 조명 하에서 상대 비교하여 농도를 확인하였다. SSR marker primer는 선행연구를 통해 알려진 60쌍(Akond et al. 2012;Nadeem et al. 2014;Zhang et al. 2006)을 선정하여 사용하였으며(Appendix 6), SSR mixture 총량을 10μL로 하여 Solog^TM e-Taq DNA Polymerase(SET15-R500, Solgent, Korea)를 사용해 10X e-Taq Reaction Buffer(25mM MgCl₂ mixed) 1μL, 10mM dNTP Mix 0.2μL, e-Taq DNA Polymerase(5U/μL) 0.1μL, F/R primer mix 0.4μL, distilled water 7.3μL를 혼합하고 DNA 1μL를 첨가하여 조성하였다. PCR mixture 증폭은 Thermal Cycler(T100^TM Thermal Cycler, Bio-Rad, USA)를 사용하였으며 95℃에서 3분 동안 initial denaturation한 후, denaturation은 94℃에 30초, annealing은 44℃에 30초로 하여 1회 반복마다 0.5℃씩 touch down을 수행하였다. Extension은 72℃에 40초씩 구성된 반응을 35번 반복 후, 72℃에서 1분 final extension 후, 4℃에 보관하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.6% agarose gel에 100V 40~50분 전기영동하여 밴드를 확인하였다.

화분 검정

해당화 및 장미 속 자원의 교배 활용을 위해 R. rugosa RRU603, JNR1475, JNR1480과 R. rugosa x R. arvensis R090145, R. sp. JNR1470, R. hybrida ‘Garden Peace’ 총 6개 자원에 대한 화분 검정을 실시하였다. 화분을 채취하여 건조오븐(OCP-UD660S, Guangdong Kangye Electric Appliance Co., LTD., China)을 이용해 35℃에서 24시간 동안 건조했으며(Kim et al. 2007) 2023년 6월 23일에 화분의 정상여부를 검경하였다. 화분 검정을 위해 증류수 55mL, Acetic acid(100%) 45mL, Carmin powder 0.5g으로 염색 시약을 제조(Acetocarmine 2010)하여 슬라이드 글라스에 100μL 분주하고 붓을 이용하여 화분을 염색 시약에 산포 해 15~30분 후, 커버글라스를 올려 광학현미경 하에서 관찰하였다(Hwang et al. 2010).

Data 분석

통계 분석은 Paleontological Statistics Software(PAST) 4.11 Program(Hammer and Harper 2001)을 이용하였다. 형태학적 분석은 81가지 데이터 중 유사 항목을 제외하고 52개의 범주형 데이터를 군집분석(cluster analysis) 하였다. 분석 시, 범주형 변수의 개체 간 거리 측정을 신뢰할 수 있는 Gower(Han and Jo 2018) 유사도 지수와 비가중평균결합법(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean, UPGMA) 알고리즘을 이용하였다. 군집분석의 신뢰도 측정을 위해 Bootstrap 1,000번 반복 분석하였다. 분자학적 분석은 밴드 유무에 따라 유는 (1), 무는 (0)으로 이진법 처리하여 UPGMA 알고리즘과 Jaccard 유사도 지수를 이용하였다. 형태적 분석과 분자적 분석의 혼합 분석 실시 전, 29개 자원을 이용 해 데이터 간 상관관계 분석으로 Mantel test를 실시하였다. 화분 검정은 6개 자원 중 RRU603, JNR1475, JNR1480, ‘Garden Peace’은 자원 당 100립씩 10반복했으며, R090145, JNR1470 2개 자원은 충분한 화분을 수집하기 어려워 확인 가능한 전체 화분에 대한 정상화분의 평균을 계산하였다.

결 과

형태학적 특성 평가를 통한 장미 속 자원의 근연관계 확인

형태학적 특성조사 데이터를 이용한 군집분석 결과, 장미 속에 해당하는 303개 자원은 총 7개 그룹으로 구분되었다(Fig. 1). 첫 번째 그룹에 해당하는 장미 속 자원들은 병충해 저항성 보유 집단이었다. 두 번째 그룹으로 구분된 찔레 원예 1호는 가시가 없으며 신초와 잎에 안토시아닌 색을 띠지 않는 특성이 있었다. 세 번째 그룹은 2가지 색의 꽃잎을 가진 자원 17점이 속했다.네 번째 그룹은 열매가 형성되지 않은 특징을 보유한 190개 자원으로 구성되었다. 반면, 다섯 번째 그룹에는 열매가 형성된다는 공통 특징이 확인되는 57개 자원이 속했다. 여섯 번째는 가장자리에 2차색이 분포하고 꽃향기가 강한 IT281547 자원이 단일 자원으로 분류되었다. 마지막으로, 일곱 번째 분류도 단일 자원으로 별모양 형태의 꽃을 가지며 다육질의 줄기가 있는 반구형 열매를 갖는 IT281491 자원이 분류되었다. 형태학적 분류 결과, 핵심적으로 영향을 끼치는 주요 형태학적 특성은 병충해 저항성, 가시 유무, 안토시아닌 발현 유무, 꽃의 2차색 유무, 꽃의 2차색 위치, 열매 형성 유무 그리고 꽃향기, 총 7개의 형태적 특성이 303점의 장미 속 자원의 큰 분류에 영향을 끼치는 것으로 확인되었다. 이러한 핵심 특성에 따라 장미 속 자원 303점 중 해당화를 활용한 정원 장미 육종을 위해 자원 29점을 선발하였다(Appendix 2, 3, 4).

해당화 및 장미 속 자원 간 유전적 다양성 평가

선발된 자원 29점의 형태학적 특성을 이용한 군집분석 결과, (1) Modern garden roses의 Shrub형 그룹, (2) Rosa 아속의 Synstylae절 및 R. sp. 그룹, (3) Rosa 아속의 Caninae 절과 Synstylae절 및 Platyrhodon 아속 그룹, (4) Rosa 아속의 Cinnamomeae절 그룹, (5) Rosa 아속의 Indicae절 그룹으로 총 5개로 나뉘었다(Fig. 2). 첫 번째 그룹에는 Garden Peace가 단독으로 분리되었으며, 가시가 없는 특징을 가졌다. 두 번째 그룹에는 R. setigera, R. sp. JNR1470이 속하며, 병충해 저항성이 있으며 열매 형성이 이루어지지 않는 공통 특성이 확인되었다. 세 번째 그룹은 뾰족한 형태의 소엽정부모양, 중간 난형의 꽃눈 형태를 갖는 야생장미 5종으로 분류되었다. 네 번째 그룹은 해당화와 해당화를 모계로 하는 자원들로 구성되었으며, 다 섯번째 그룹의 R. chinensis는 꽃잎에 2차색을 띠어 단일 자원으로 분류되었다.

선발된 자원 29점의 분자학적 분석을 이용한 군집분석 결과, 총 300개의 밴드를 획득하였으며 (1) Rosa 아속의 Synstylae절 그룹, (2) Rosa 아속의 Caninae절과 Indicae절, Synstylae절 및 Modern garden roses 그룹, (3) Platyrhodon 아속과 R. sp. 그룹, (4) Rosa 아속의 Cinnamomeae절 그룹으로 총 4개로 나뉘었다(Fig. 3). 첫 번째 그룹에는 R. filipes가 단독으로 분리되었으며, 두 번째 그룹은 야생장미 5종 R. setigera와 R. chinensis, Bennett’s seedling, R. moschata, R. corymbifera, 현대 장미 ‘Garden Peace’ 1점으로 분류되었다. 세 번째 그룹은 야생종 R. roxburghii 와 R. sp. JNR1470으로 구성되었다. 마지막으로, 네 번째 그룹은 해당화 자원들로 분류되었다.

각각의 군집분석 결과 확인 후, 형태적 및 분자학적 분석 간 상관관계가 있는지 알아보고자 Mantel test를 실시하였다. 형태적 유사도와 분자학적 거리 간 유의성 R값은 0.5987로 중간 정도의 상관관계를 보였다. 자원들이 형태적 특성을 이용한 군집화 결과에서는 유사한 형태학적 특성으로 분류되는 특성들이 많아 아속간의 혼합되는 경우가 있었지만, 분자학적 결과에서는 아속간의 혼합되는 경우가 아속 별로 분류되어 중간 정도의 상관 관계를 보였다. 이에 따라 견고한 분류를 위해 두 가지 데이터를 활용하여 혼합 군집분석을 실시하였다. 그 결과, (1) Rosa 아속의 Indicae절 그룹, (2) Rosa 아속의 Caninae절과 Synstylae절 및 Platyrhodon 아속과 Modern garden roses, R. sp. 그룹, (3) Rosa 아속의 Cinnamomeae절 그룹으로 총 3개로 나뉘었다 (Fig. 4). PCoA 분석의 처음 두 구성 요소는 29개의 자원을 그룹화하는 동안 42.84%와 11.45%의 분산을 나타냈으며 첫 번째 그룹에 R. chinensis가 단독 분리되어 형태적 결과와 동일한 것으로 확인되었다(Fig. 5). 두 번째 그룹은 Rosa 아속의 두 가지 절에 해당하며 야생종은 단독 분석 결과와 유사하게 확인되었으며 추가적으로 장미 속 자원 ‘Garden Peace’와 JNR1470이 같은 그룹으로 나뉘었다. 세 번째 그룹은 해당화 자원들로 구성되었으며 다섯 가지 서브 그룹으로 분류되었다.

이에 29가지 자원 중 교배에 이용할 자원으로 장미 속 자원과 유전적 거리가 멀지 않으며 형태학적으로 관상적 가치가 있는 분홍 해당화 RRU603, 흰색 해당화 JNR1475, 겹꽃 해당화 JNR1480을 해당화 자원으로 선발하였다. 해당화와 교배할 장미 속 자원으로는 가시가 없는 Garden Peace, 종간 교잡체이며 잎의 형태가 특이한 R090145, 겹꽃 형태인 JNR1470을 선발하여 총 6점을 육종재료로 이용하고자 한다.

화분 검정

형태적 및 분자적 혼합분석 결과에 따라 선발된 R. rugosa RRU603, JNR1475, JNR1480과 R. hybrida ‘Garden Peace’, R. rugosa x R. arvensis R090145, R. sp. JNR1470 총 6가지 자원에 대한 교배 적합성 평가를 위해 정상화분의 검정을 실시하였다. 선발된 자원 6점의 화분 검정 결과, 해당화 종의 3점은 정상화분의 비율이 약 95~99% 이상이었으며 장미 속 자원은 1개를 제외하고 약 90% 이상으로 확인되었다. R090145와 JNR1470은 꽃가루 수가 한 개의 표본 당 각각 206, 259개로 매우 적었다. JNR1470은 확인된 꽃가루에서 90% 이상의 정상화분율을 보였다. 하지만 종간 교잡체인 R090145는 48.5%로 정상화분의 비율이 가장 낮았다. 따라서 선발한 6가지 자원을 육종 재료로 이용하고자 실시한 화분 검정을 통해 1개의 자원을 제외하고 정상화분의 비율이 대부분 90% 이상으로 확인되었다(Table 1, Fig. 6).

고 찰

장미 속 자원의 유전적 다양성 평가

장미 속 자원 29점의 형태적 군집분석 결과, 야생종 6종 59계통을 사용하여 형태학적 분류를 실시한 Singh et al.(2020)의 연구와 같이 동일한 종 별로 군집화되었다. 세부적으로 확인하였을 때 장미 분류체계와 유사한 자원을 사용한 Joung et al.(2010)의 결과에서는 Rosa 아속과 Platyrhodon 아속이 구분 되었다. 하지만 본 연구에서는 두 가지 아속이 구분되지 않았다. Singh et al.(2020)는 Rosa 종 자원들의 형태학적 다양성이 연속적인 성격을 가져 특성 간 강한 중첩에 의한 것이로 판단하며 자원을 구별하는 데는 몇 가지 특성이 있다 보고하였다. 이에 따라 본 연구를 통한 형태학적 특성 데이터를 이용한 군집 분석 결과는 가시 크기, 암술 특성, 턱잎 및 꽃받침 가장자리 형태 등의 주요 형질을 대입하지 않아 구분이 어려웠던 것으로 생각된다.

분자학적 군집분석 결과, 형태적으로 분류되지 않은 Rosa 및 Platyrhodon 아속이 구분되었다. 이는 Koopman et al.(2008) 의 연구 결과, Platyrhodon 아속이 Rosa 내에서 분리된 것과 동일하였다. 이에 따라 자원의 명확한 분류를 위해 분자학적 분석 결과의 혼합은 필수적이다. 세부적으로 Rosa 아속의 Caninae, Synstylae절이 그룹을 형성하였으며 이는 De Riek et al.(2013)의 AFLP 분석에서도 유전적 거리가 가깝게 분류되 었다. Indicae절에 해당하는 R. chinensis 종 또한 Caninae, Synstylae절과 그룹을 형성하였다. Matsumoto et al.(1998)와 Wu et al.(2000)의 연구를 통해 Indicae와 Synstylae절이 서로 중첩되었으며 계통발생학 연구를 통해서도 두 가지 절이 군집화되었다(Qiu et al. 2012). 이를 통해 두 절이 형태학적 분류뿐만 아니라 유전적으로도 관련 있어 명확한 분류를 위해 주요 형태적 특성에 대한 데이터의 추가와 분자학적 분석을 위한 추가적인 분자표지 개발이 필요할 것으로 사료된다.

혼합 분석을 실시하였을 때, 그룹 2에서 현대장미와 야생종이 하나의 그룹을 형성하였다(Fig. 4). 이는 MacPhail and Kevan(2009)의 연구에서 10가지 야생장미가 현대장미 육성에 이용되었다는 것을 뒷받침하였다. 다음으로 그룹 2 내에서 R. roxburghii와 JNR1470 자원이 개별 분석 시보다 유전적 거리가 가깝게 그룹을 이루었다(Fig. 4). 두 자원은 형태학적으로 꽃에 대한 차이점을 보였지만, 잎과 꽃받침통, 가시는 매우 유사하였다. SSR 분석 결과에서도 두 자원의 공통 밴드를 확인하였다. Nadeem et al.(2014)의 SSR 분석 결과, 모부본 품종 및 잡종 식별 시, 자손의 일부 대립 유전자가 두 부모에서 모두 동일하거나 부모 중 하나의 특성을 나타내는 유사성을 보였다. 이에 따라 혼합 분석 결과를 통해서도 자원의 품종 및 잡종 유추가 가능해질 것으로 사료된다.

화분 검정

본 실험 결과 해당화는 다른 장미 종과 달리 정상화분의 비율이 높게 나타났으며 이는 이전연구와 유사하였다(Żuraw et al. 2015). 그 외, 장미 속 자원의 ‘Garden Peace’와 JNR1470은 정상화분이 90% 이상, R090145는 다른 자원과 달리 48%의 비율을 보였다. Żuraw et al.(2015)은 4가지 장미 종의 화분 검정률이 40.0~94.8%까지 다양하게 보고한 바 있고, Hwang et al.(2010)은 39%의 화분 검정률을 가진 장미 품종 ‘Pinocchio’를 모·부본으로 사용한 교배에서 9.1~54.3%의 착과율을 확인하였다. 이에 따라 종·품종별 정상화분율의 차이가 크게 날 수 있으며, 정상화분이 50% 이하로 확인되어도 교배 자원으로써 활용이 가능하여 R090145를 육종 재료로써 활용할 수 있을 것으로 생각된다.

또한, 본 연구에서는 Aceto-carmine 용액을 이용해 화분의 정상여부를 평가하였다. Han and Yu(2002)는 교배 모본으로 활용될 꽃의 크기, 꽃잎 수, 화분의 풍부함 및 발아율도 수정율에 영향을 주며 장미 교배 친화성에 대한 연구가 미비한 실정이라 보고하였다. 이에 따라 효율적인 육종을 위한 추가적인 화분 임성 평가와 본 실험을 통해 선발된 자원의 교배 친화성 연구가 필요할 것으로 생각된다. 이러한 결과를 바탕으로 장미 속 자원 유전자원 관리기관(전남대학교 화훼원예학실험실)의 보유 자원 303점의 근연 관계와 해당화의 유전적 다양성 평가를 통해 국제 시장에서 경쟁력 있는 정원 장미 육종에 이용되기를 기대한다.