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ISSN : 1225-5009(Print)
ISSN : 2287-772X(Online)
Flower Research Journal Vol.31 No.4 pp.364-377
DOI : https://doi.org/10.11623/frj.2023.31.4.21

Growth and Physiological Responses in Sanguisorba hakusanensis to Different Irrigation Cycle and NaCl Concentration
관수주기 및 NaCl 농도에 따른 산오이풀의 생육과 생리적 반응

Jin Woo Kim, Song E Jeong, Hyuck Hwan Kwon, Wonwoo Cho*
Garden and Plant Resources Division, Korea National Arboretum, Pocheon 11186, Korea

김진우, 정송이, 권혁환, 조원우*
국립수목원 정원식물자원과
Correspondence to Wonwoo Cho Tel: +82-31-540-8956
E-mail: wonwoocho85@korea.kr
15/11/2023 19/12/2023

Abstract


In Korea, despite the abundance of native plant species suitable for gardening, incorporating many natives, such as Sanguisorba hakusanensis, into gardens has proven challenging due to limited information about their growth and physiological traits, responses, and adaptability to alternative environments. This study aimed to identify the drought and salinity tolerance, along with stress responses, in S. hakusanensis by investigating their growth, chlorophyll fluorescence, enzyme components, and inorganic components under varying drought and salinity conditions controlled by different irrigation cycle and NaCl concentration, respectively. As a result, no significant differences were observed in the responses of S. hakusanensis to different irrigation cycle in which NaCl was not treated, except for a decrease in total chlorophyll content under the most rarely irrigated condition. However, these results do not suggest that S. hakusanensis has strong drought tolerance because controlling irrigation in this study did not induce sufficient drought condition to cause drought stress to S. hakusanensis. Under salinity conditions, all individuals experienced rapid salinity stress only after two weeks of NaCl treatment. This suggests that S. hakusanensis exhibits tolerance to osmotic stress, the initial phase induced by salinity stress, but is unable to withstand ionic stress, the subsequent phase. The analysis of the inorganic components in S. hakusanensis leaves indicated a response to alleviate toxicity caused by sodium accumulation. This study reveals that S. hakusanensis has tolerance to osmotic stress and mechanisms to release intracellular sodium and to reduce intracellular sodium concentration to alleviate ionic toxicity. This suggests that S. hakusanensis has the potential to tolerate drought stress, which was not observed in this study, because plant responses to osmotic stress and drought stress are cognate. Furthermore, since S. hakusanensis possesses a tolerance mechanisms against ionic stress, it has the potential to adapt to low concentration of NaCl.




산오이풀(Sanguisorba hakusanensis)은 한국의 자생식물 이며 정원소재로써 가치가 있지만, 생육 및 생리적 특성 및 정 원 적응 여부에 대하여 알려진 정보가 많지 않아 이용에 어려 움을 겪고 있다. 본 연구에서는 자생식물인 산오이풀의 관수 주기 및 NaCl 농도에 따른 생장, Fv/Fm, NPQ, 성분 변화, 무기성분 변화를 조사하여 내건 및 내염성 보유 여부, 생육 한 계 범위, 스트레스 환경에서 생육을 유지하기 위한 반응을 파 악하고자 했다. 실험 결과 NaCl 무처리구의 관수주기에 따른 성분 분석에서 엽록소 함량의 감소를 제외하고 유의한 차이가 나타나지 않았으나 이는 토양수분함량이 건조 스트레스를 유 발할 정도로 감소하지 않았기 때문으로 보인다. 염 처리에서 는 2주 이후 급격한 스트레스 반응이 나타났고 3주차부터 고 사하기 시작하여 6주차에 모든 개체가 최종 고사했다. 이러한 결과는 2주까지 염 스트레스에 의해 유발되는 2가지 스트레 스 중 초기에 나타나는 삼투 스트레스에는 저항하였으나 이후 나타나는 NPQ의 감소 등 이온 스트레스에 의해 유발된 광합 성 기구 붕괴로 인해 정상적인 생육을 유지할 수 없었기 때문 에 나타난 것으로 보인다. 그러나 무기이온 분석은 이온 스트 레스에 저항하기 위한 메커니즘의 존재 가능성을 시사하였다. 상대적으로 염 농도가 낮을 때에는 세포내 Ca2+ 및 K+ 수준이 높았는데, 이는 Ca2+ 수준이 높아짐에 따라 Na+를 세포 밖으 로 방출시키는 단백질, Na+를 K+와 함께 수송하는 단백질이 기능하여 Na+축적을 지연시키는 반응이 있었음을 시사한다. 그러나 NaCl을 고농도로 처리했을 때는 이러한 반응이 관찰 되지 않았다. 따라서 산오이풀은 염 스트레스에 의해 야기되 는 삼투 스트레스에 강한 저항성을 가지고 있고 이온 독성을 줄이기 위한 메커니즘으로 Na+ 세포내 축적을 지연시키는 것 으로 보이지만, 심한 염 스트레스를 받았을 때 나타나는 급격 한 반응에서 이러한 메커니즘이 기능하지 못하고 이온독성에 매우 취약한 것으로 여겨진다. 본 연구를 통해 자생식물인 산 오이풀의 활용을 늘리는 데 기초적인 자료를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.


chlorophyll fluorescence , drought stress , ionic stress , salinity stress , salinity tolerace , Sanguisorba hakusanensis

엽록소 형광 , 건조 스트레스 , 이온 스트레스 , 염 스트레스 , 내염성 , 산오이풀

초록

    서 언

    국내 정원은 대부분 도심환경에 크고 작게 조성되거나 도외 지역이라도 개울가, 평지, 해안, 산자락에 조성되었다(Cho and Sung 2019). 자생식물은 자생환경에 맞게 고유의 특성 을 발달시키며 적응해왔지만, 정원 환경은 식재된 자생식물의 자생환경과 다소 상이한 경우가 많다. 식물은 생육환경에 따 라 온도, 습도, 광 등의 비생물적 요인과 병해충, 경쟁 등의 생물적 요인에서 기인하는 다양한 스트레스를 받게 된다. 이 러한 스트레스는 인간활동 및 기후변화의 영향으로 대부분의 생태계의 환경조건이 점점 열악해지면서 그 영향력이 커지고 있고(Chen et al. 2010;Onyekachi et al. 2019;Pereira et al. 2010;Rubio et al. 2010), 특히 전세계적으로 건조와 염에 대한 연구의 중요성과 스트레스 내성 식물의 이용이 강 조되고 있다(Singh et al. 2015).

    식물은 건조 스트레스를 받으면 수분 결핍, 세포 팽압 감 소, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 과다생산 으로 인해 무기양분이 결핍되고 광합성 기구에 악형향을 받아 결과적으로 생장이 감소하게 된다(Dugasa et al. 2019;Goharrizi et al. 2020). 염 스트레스는 식물에게 삼투 스트 레스와 이온 스트레스를 유발하고 원형질 분리, 무기양분 불 균형, ROS생산, 광합성 기구의 결함을 초래하여 생장을 감소 시킨다(Galmés et al. 2011;Jagesh et al. 2010;Jenkins et al. 2010). 특히 건조나 염과 같은 환경 스트레스는 삼투압 불균형을 초래하여 광계II(Photosystem II)와 같은 광합성 기구에 직간접적인 손상을 줄 수 있으며(Takahashi and Murata 2008), 이러한 현상은 엽록소 형광 분석을 통해 수박 (Citrullus lanatus, Shin et al. 2021a), 바질(Ocimum basilicum, Lazarević et al. 2021), 상추(Lactuca sativa, Shin et al. 2021b) 등 많은 식물에서 관찰되어왔다. 또한, NaCl에 의한 염 스트레스는 Na+ 이온 농도의 증가를 초래하는데, 이로 인 해 나타나는 이온 농도의 불균형은 식물의 대사장애, 영양결 핍 등을 야기하며(Singh and Prasad 2009), 심하면 식물을 고사시킬 수 있다. NaCl에 의한 염 스트레스는 모든 식물체 에서 관찰되지만, 종에 따라 다른 내성 수준을 보인다(Choi et al. 2003;Parida and Das 2005).

    산오이풀(Sanguisorba hakusanensis)은 장미과 오이풀속 에 속하는 여러해살이풀로 높은 해발고도의 암석지 및 초지에 자생한다고 알려져 있으며(Kong et al. 2017), 아름답고 이 식이 용이하여 정원소재로써 가치가 있다(Jang 1999). 산오 이풀의 자생환경인 고산환경은 평지에 비해 낮은 온도, 고광, 양분 및 수분 결핍, 강풍 등의 다양한 환경 스트레스에 식물들 이 더 빈번하게 노출될 수 있다(Körner 2003;Stöcklin et al. 2009). 이러한 환경 스트레스는 식물 체내 산화 스트레스 를 유발하는 O2-, H2O2 등 ROS의 과다생산을 야기하므로 식 물은 생존을 위해 산화 스트레스를 중화시키는 메커니즘을 보 유하고 있다. 산오이풀은 tannin, catechin, pomolic acid 등 다양한 2차 대사산물을 함유하고 있는데 이들은 강력한 항 산화기능을 가진 것으로 알려져 있다(Ahmad et al. 2008;Ho et al. 1999;Kwon et al. 1996). 이 외에도 ascorbate peroxidase(APX), superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), peroxidase(POD) 등 ROS의 독성으로부터 세포를 보호하기 위한 다양한 항산화물질이 존재하는데, 산오이풀과 같이 높은 해발고도에 자생하는 식물들은 항산화물질에 의해 낮은 해발 고도에 자생하는 식물들에 비해 산화 스트레스로부터 큰 저항 성을 가지고 있다고 알려져 있다(Polle et al. 1999;Streb et al. 1998;Wildi and Lütz 1996).

    본 연구에서는 건조 및 염 스트레스가 산오이풀의 생육과 생리적 반응에 끼치는 영향을 조사하기 위해 엽록소 형광을 분석하고 스트레스 관련 지표로써 항산화물질 및 산화물질 등 의 대사산물과 무기이온 함량을 분석했다. 이를 통해 자생식 물인 산오이풀의 건조 및 염 스트레스 아래에서 생육을 유지 하기 위한 반응 및 최적의 생육 환경을 파악하여 산오이풀의 활용을 늘리는 데 기초적인 자료를 제공할 수 있을 것으로 생 각된다.

    재료 및 방법

    실험 재료

    본 연구는 2023년 6월 29일부터 6주간 국립수목원 유용식 물증식센터 내 실험온실에서 실시되었다. 실험에 사용된 산오 이풀(Sanguisorba hakusanensis) 개체들은 2023년 4월 국 립수목원 유용식물증식센터 재배온실에서 생육하고 있던 모주로부터 분주되었다. 분주된 산오이풀은 상업용 원예상토 (Baroker, Seoul Bio, Eumseong, Korea)를 이용하여 사각 포트(135×135×155mm)에 식재 된 후 재배온실에서 8주간, 실험온실로 옮겨져 2주간 순화처리 되었다. 실험기간 동안 온 습도는 데이터 로거 내장 센서, 광량은 외부 센서(Lightscount Quantum Light Sensor, Spectrum Technologies Inc., Illinios, USA)를 데이터 로거(Watchdog 1000 Series Micro Stations, Spectrum Technologies Inc., Illinios, USA)에 연결하여 모니터링 되었다.

    실험 처리

    실험은 산오이풀이 2주간 순화처리 되었던 실험온실 (37°28'43.3"N 127°35'54.3"E)에서 수행되었다. 산오이풀의 건조 및 염 스트레스에 대한 반응을 알아보기 위해 관수주기 와 NaCl 농도를 각각 3가지로 처리하였다. 일반적으로 토양 EC가 4dS･m-1 이상인 토양에서 식물 생장을 유의하게 감소시 킨다고 알려져 있다(Munns and Tester 2008;USDA-ARS 2020). 본 실험 전에 수행된 예비실험에서 300mM 이상의 NaCl 농도에서 4dS･m-1 이상의 substrate EC가 나타났으 며, 식물들이 모두 고사하였다. 따라서 본 실험에서 NaCl의 처리별 농도를 0, 100, 200mM로 설정하였고, 관수주기는 매 일, 3일, 7일 마다 24시간 저면관수 처리하였으며 매일 저면 관수 된 처리구는 24시간 마다 물을 갈아주었고 실험기간 동 안 항상 저면관수 되었다. 총 처리구는 9개(0mM NaCl 매일 관수(control, 0mM ed), 0mM NaCl 3일마다 관수(0mM 3d), 0mM NaCl 7일마다 관수(0mM 7d), 100mM NaCl 매 일 관수(100mM ed), 100mM NaCl 3일마다 관수(100mM 3d), 100mM NaCl 7일마다 관수(100mM 7d), 200mM NaCl 매일 관수(200mM ed), 200mM NaCl 3일마다 관수 (200mM 3d), 200mM NaCl 7일마다 관수(200mM 7d))로 NaCl무처리구(0mM ed, 3d, 7d)에는 증류수를 관수했다. 토 양수분함량 및 substrate EC의 모니터링에 이용된 토양수분 및 EC 센서(WT1000B, RF Sensor, Seoul, Korea)와 data logger(WP700, RF Sensor, Seoul, Korea)는 센서에 내장 된 보정값을 이용하였으며, 이 보정값은 대한민국의 일반적인 토양인 사질양토에 맞게 보정되었다. 실험은 완전 임의 배치 법이 이용되었으며, 개체 반복은 3반복되었다.

    생육 특성 측정

    건조 및 염 스트레스에 대한 산오이풀의 생육 반응을 조사 하기 위해 생존율, 지상부 및 지하부의 생중량 및 건중량이 측 정되었다. 생존율은 식물체의 지상부와 지하부가 고사하고 신 초가 발생하지 않는 개체를 고사한 것으로 판단했으며 1주일마 다 확인됐다. 실험종료 직후, 생존한 산오이풀의 줄기 가장 위 쪽의 뿌리가 발생한 지점부터 첫번째 마디에서 지상부와 지하 부를 구분하여 생중량을 측정했다. 건중량은 건조기(OF-02G Forced convention oven, Jeio Tech, Daejeon, Korea) 를 이용하여 70℃에서 72시간 동안 건조된 이후 건중량이 측 정되었다. 측정된 값들을 바탕으로 F/D(Fresh weight/dry weight), RSR(Root dry weight/shoot dry weight)가 계산 되었다.

    엽록소 형광 분석

    엽록소 형광 반응 분석을 위해 휴대용 엽록소 형광 측정기 (PAM-2500, Walz, Bavaria, Germany)가 이용되었으며, 식물 스트레스에 대한 식물의 반응을 조사하기 위해 이용되 는 대표적인 엽록소 형광 분석 요소인 Fo, Fm, Fv/Fm, NPQ (nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching) 가 조사되었다. 조사는 줄기의 가장 상층으로부터 두번째 잎 에서 2주마다 시행되었다. 측정은 각 개체마다 3개의 다른 잎 에서 측정하여 평균하였다. 4주차 이후 고사한 개체에 대한 측정은 진행되지 않았고, 생존한 개체에서 여러 번 반복 측정 되었다. 엽록소 형광 측정은 30분간 암적응된 잎에 광을 30 초간 조사하여 최소형광 Fo을 측정하고, 포화광을 90초간 조 사하여 암적응 시의 최대형광 Fm을 측정했다. 측정된 결과를 바탕으로 Fo과 Fm의 차이인 Fv, Fm에 대한 Fv의 상대적인 크기인 Fv/Fm가 계산되었다. NPQ는 암적응된 잎과 광적응 된 잎의 최대 형광을 통해 광계II에서 흡수시키지 않고 손실시 킨 값의 추정치이다(Baker 2008).

    스트레스 관련 효소 및 성분 분석

    건조 스트레스에 대한 산오이풀의 스트레스 반응 물질의 변 화를 조사하기 위해 superoxide dismutase activity(SOD), peroxidase activity(POD), malondialdehyde(MDA), proline, 엽록소 함량, DPPH가 분석되었다. 분석에는 모든 잎이 완전 히 전개된 줄기의 잎이 이용되었다. 수확된 식물체는 –70℃에 서 보관하였다.

    SOD 활성 분석.

    SOD 측정을 위해 다음과 같이 효소 추출물이 준비되었다. 분말화된 시료 20mg을 50mM pH 7.0 Sodium Phosphate buffer 2mL에 섞고 Islam et al.(2017)에서 설명한 방법으로 액체질소, 얼음 및 물을 이용하여 동결융해를 3회 반복해 세포 용해를 진행하였다. 이후 4℃ 15,000rpm으로 5분 원심분리 (Smart 15 plus, Hanil Scientific lnc., Gimpo, Korea) 후 상층액을 분리하여 분석에 이용하였다.

    SOD는 Gupta et al.(1993)의 방법이 적절히 변형되어 측정되었다. 50mM pH 7.0 sodium phosphate 93.5μL, 0.1M methionine 52μL, 2.5mM NBT 24.5μL, 10mM EDTA 2μL, 0.5mM riboflavin 8μL를 섞어 혼합물을 제조 하였다. 대조구는 효소 추출물 들어가지 않은 것으로 시료와 같 이 동시에 PPFD 50μmol･m-2･s-1의 LED 광에 15분간 노출시 킨 후 빛을 차단하였다. 분광광도계(X-ma 1200, Human, Seoul, Korea)를 이용하여 560nm에서 흡광도를 측정하였으 며, NBT를 50%까지 감소시키는 효소의 양을 1 unit으로 하 여 SOD 활성도를 다음 공식에 대입하여 unit mg−1 FW로 나타내었다. Blank는 혼합물에 효소 추출물이 들어가지 않은 것으로 암상태에서 보관 후 흡광도 측정하였고 열평형 상태를 확인하였다.

    POD 활성 분석.

    POD 측정을 위한 효소 추출은 SOD 활성 측정에서의 방법과 동일하게 진행되었다. POD 활성 측정은 Rao 등 (1996)의 방법을 적절히 변형시켜 진행되었다. 0mM pH6.1 sodium phosphate buffer 66.6μL, 20mM guaiacol 80μL, 3% H2O2 33.3μL를 섞어 제조한 혼합물에 효소 추출물 20μL를 넣고 470nm에서 10초마다 흡광도를 측정하였으며, 다음 공식에 대입하여 POD 활성도를 μmol･min−1･mg−1 FW 로 계산하였다. Blank는 혼합물에 효소 추출물이 들어가지 않 은 것으로 흡광도 측정 결과 열평형 상태를 확인하였다.

    MDA 분석.

    MDA 분석은 Du와 Bramlage (1992)의 분석법 을 변형하여 사용하였다. 식물체 시료를 0.15g씩 채취하여 액화질 소에 마쇄하고 4℃ 70.0% ethanol을 첨가하여 시료를 균질화하였 다. 이후 4℃ 15,000×g에서 15분간 원심분리기(M15R, Hanil Scientific lnc., Gimpo, Korea)를 이용하여 원심분리하였다. 시료의 상층액 2mL과 20.0% trichloroacetic acid(TCA) 2mL, 20.0% TCA에 용해된 0.67% thiobarbituric acid(TBA) 1mL와 100mM butylated hydroxytoluene(BHT) 50μL을 첨가하여 항온수조(WB-11, Daihan Scientific Co., Wonju, Korea)를 이용하여 95.0℃에서 15분간 진탕 후 냉각하여 사용하였다. 이 후 과산화지질이 포함된 용액을 15,000×g에서 15분간 원심분 리한 후 상층액의 흡광도를 450nm, 532nm, 600nm에서 측정 하였다.

    Proline 분석.

    Proline 분석은 Bates et al.(1973)의 방법 을 이용하였다. 0.5g의 잎을 액체질소를 이용하여 마쇄하고 3.0% sulfosalicylic acid 10mL을 첨가하여 균질화 시킨 후 4℃ 4,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액 1mL, acid-ninhydrin 1mL, acetic acid 1mL을 혼합하고 항온수 조를 이용하여 95℃에서 60분간 진탕 처리 후 냉각시켰다. Acid-ninhydrin은 acetic acid 60mL, 6M phosphoric acid 40mL를 혼합하고 2.5g의 ninhydrin을 첨가하여 조제하 였다. 반응이 종료된 용액에 toluene 3mL을 첨가 후 30초간 교반하고, 상온에서 10분간 정지시켜 반응 용액의 발색을 분리 하였다. Proline의 정량은 toluene을 blank 값으로 사용하여 흡광도 520nm에서 각 시료의 반응값을 측정하였다.

    엽록소 함량 분석.

    엽록소 추출 및 측정은 Hiscox and Israelstam(1978)의 방법을 변형해 사용하였다. 시료 0.25g을 dimethyl sulfoxide(DMSO) 5mL에 침지하여 60℃의 암조건 에서 6시간 동안 색소를 추출한 후 분광광도계를 이용하여 663nm와 645nm의 파장에서 흡광도를 측정하고 다음 식으로 엽록소 a, b의 함량과 총 엽록소 함량을 산출하였다(Arnon 1949;Mackinney 1941).

    DPPH 분석.

    2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 분석 은 Braca 등 (2001)의 분석법을 변형하여 사용하였다. 식물체 시료 0.03g를 액화질소에 마쇄하고, 99.0% ethanol을 첨가하 여 시료를 균질화하였다. 이후 4℃, 12,000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 시료의 상층액 0.9mL와 0.5mM DPPH 용액 0.6mL를 혼합 후 실온에서 암상태로 30분 처리한 후 571nm에 서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 혼합하 여 이용하였다.

    무기성분 분석

    건조 및 염 스트레스에 의한 무기성분 축적량을 확인하기 위해 ICP-MS(inductively coupled plasma mass spectrometry) 및 IC(ion chromatography) 분석을 수행하였다. 분석에 이 용된 산오이풀의 잎은 실험 종료 직후에 채집되었으며, 고사 한 개체는 고사 직후 채집되었다. 잎은 -70℃에서 동결 보관 되다가 70℃에서 72시간 이상 건조 후 분석에 이용되었다.

    K+, Na+, Ca2+, Mg2+ 분석.

    산오이풀 잎의 무기성분 분석을 위해 ICP-MS(Nexion, Perkin Elmer, Massachusetts, USA) 가 이용되었다. 이는 Ar gas를 이용하여 유도결합플라즈마를 원자화 및 탈 용매화 하여 여기된 원자가 바닥상태일 때의 에너 지를 분광시켜 얻은 특정한 세기 및 파장으로 원자의 농도를 측정하는 방법으로 잎을 적절한 방법으로 전처리 한 후 분석에 이용하였다(Jeong 2020;Wilschefski and Baxter 2019). 기기 조건으로 RF generator 40MHz, RF power 1.4kW로 설정하 고, Ar gas는 분당 nebulizer 1.05L/min, auxiliary 2.0L/min, coolant 17L/min로 흘러주었다.

    Cl- 분석.

    음이온인 Cl-는 IC(ICS-5000, Thermo Fisher, Massachusetts, USA)를 통해 분석되었다. IC는 이온마다 띠고 있는 고유의 이온 반경, 소수성 등의 특성을 이용하는 방법으로 시료가 column을 따라 이동하며 분리되고, 표준물질과 시료의 peak를 비교하여 이온들을 정량 분석한다. Column은 guard AG19 4×50mm, separator AS19 4×250mm, isocratic mobile phase는 KOH 10mM, flow rate는 1.0mL･min-1, Injection volume은 25μL로 분석이 진행되었다.

    통계 분석

    통계분석은 SPSS Statistics 프로그램(IBM SPSS Statistics 20, IBM Co., New York, USA)을 이용하여 수행되었다. 분 석 방법으로는 analysis of variance(ANOVA), Duncan’s multiple range test(p≤0.05)가 이용되었다. 생존율을 제외 한 생육 특성 분석 및 성분 분석은 NaCl 처리구를 제외하고 수행되었다.

    결 과

    관수 및 NaCl 처리에 의한 산오이풀 생육 차이

    6주간의 실험결과 실험온실 평균 주/야, 최고, 최저온도, 습도, 광량은 각각 29.4/24.7, 33.3/23.2℃, 82.5%, 216.6μ mol･m-2･s-1로 나타났다. 매일(ed), 3일(3d), 7일(7d)마다 관 수한 처리구의 평균 토양수분함량은 각각 72.7, 62.0, 48.9%로 나타났고(Fig. 1A), 처리구별 평균 substrate EC는 0.29(0mM ed), 0.36(0mM 3d), 0.42(0mM 7d), 2.61(100mM ed), 2.13(100mM 3d), 1.74(100mM 7d), 3.16(200mM ed), 2.42(200mM 3d), 1.93(200mM 7d)dS･m-1으로 나타났다 (Fig. 1B).

    처리구별 생존율은 모든 NaCl 처리구에서 0.0%, NaCl 무 처리구에서는 100.0%로 나타났다. NaCl처리구에서 모든 개 체가 6주까지 최종적으로 고사했지만 고사하는 속도는 처리 구별로 다르게 나타났다(Fig. 2). 가장 일찍 고사가 나타난 처 리구는 200mM ed였으며, 2주차 까지는 고사하지 않았으나, 3주차에서 33.3%의 생존율을 보였고, 4주 이후 모든 개체가 고사했다. 가장 늦게 고사가 나타난 처리구는 100mM 3d, 7d였으며, 3주차까지 모든 개체가 생존하다가 4주차부터 66.7, 50.0, 0.0%의 생존율을 보였다.

    지상부 및 지하부의 생중량과 건중량은 NaCl 처리구의 개 체가 모두 고사했기 때문에 NaCl 무처리구(0mM ed, 3d, 7d)에서만 조사되었고, 이를 통해 F/D, RSR 값이 계산되었 다. 조사 결과 세 처리구 간 유의성은 없었다(Table 1).

    관수 및 NaCl 처리에 대한 엽록소 형광 반응

    엽록소 형광 분석 결과, 모든 처리구에서 Fv/Fm은 0주차 와 비교하여 2주차까지 유의한 변화가 없었다. 그러나 4주차 의 Fv/Fm은 0, 2주차와 비교하여 모든 처리구에서 감소하는 경향을 보였다(Table 2, Fig. 3). 감소폭은 200mM NaCl처 리구에서 약 18.8% 감소하여 가장 크게 나타났고, 100mM, 0mM 처리구 순으로 감소폭이 작아졌다(Fig. 3A, C, E). 0mM 처리구의 2주차와 4주차 간 Fv/Fm 값 차이는 평균 0.13으로 작은 감소폭을 보였으나, NaCl 처리구의 Fv/Fm 는 상대적으 로 극단적인 감소가 나타났으며, NaCl을 관수한 모든 처리구 에서 Fv/Fm 값이 0.79 이하인 것으로 확인 되었다(Table 2). 시간에 따른 Fv/Fm 변화는 NaCl 농도에 관계없이 유의성을 보였다(0mM, 100mM, 200mM NaCl 처리구 p≤0.001, 각 R2=0.716, 0.913, 0.742). 관수주기별 NaCl 처리 농도 및 시 간에 따른 Fv/Fm 변화는 모든 관수주기에서 유의성이 확인 됐다(Fig. 3A, C, E).

    NPQ(nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching)는 0주차와 비교하여 2주차에서 증가하거나 감소 하여 일관된 반응이 나타나지 않았다. 그러나 4주차에서 0mM 3d, 7d를 제외하고 모든 처리구에서 감소하였다(Fig. 3B, D, F). NaCl 처리 농도별 관수주기 및 시간에 따른 NPQ 의 변화도 Fv/Fm에서 나타난 결과와 같이 100mM NaCl 처 리구에서만 유의하게 나타났다. 그러나 관수주기별 NaCl 처 리 농도 및 시간에 따른 NPQ 변화는 매일 관수한 처리구에서 만 유의성이 확인되지 않았다. Fv/Fm은 2주차부터 대략 0, 100, 200mM 순으로 높게 나타난 반면, NPQ는 상대적으 로 2주차에서 NaCl 농도 차이에 따른 일관된 순서를 보이 지 않았다. 그러나 4주차에서는 Fv/Fm과 마찬가지로 0, 100, 200mM 순으로 높게 나타났다(Fig. 3B, D, F).

    관수 처리에 대한 성분 차이

    NaCl 처리구의 모든 산오이풀이 고사했으므로, 0mM ed, 3d, 7d의 산오이풀에 대한 성분 분석이 수행되었다. SOD, POD, MDA, proline, total chlorophyll contents, DPPH분 석 결과, total chlorophyll contents를 제외한 모든 분석에서 3 처리구에 대한 유의성이 나타나지 않았다(Table 3). 처리구 별 총 엽록소 함량은 ed, 3d는 각각 9.78, 10.00mg･g-1FW로 통계적 유의성이 나타나지 않았으나, 7d에서 7.34mg･g-1FW 으로 총 엽록소 함량이 감소한 것으로 나타났다.

    관수 및 NaCl 처리에 대한 무기성분 분석

    관수 및 NaCl 처리에 의한 산오이풀의 무기성분 변화를 분 석하기 위해 5가지의 이온(K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Cl-)이 분석 되었다(Table 4). Cl-은 200mM ed 처리구를 제외한 모든 처 리구에서 200mg･kg-1 미만으로 검출되어 IC를 통한 구체적 인 정량 분석이 이루어지지 않았다. Na+은 처리된 NaCl의 농 도에 따라 많은 양이 검출되었다. 200, 100mM 처리구의 평 균 Na+은 각각 0mM 처리구의 약 102, 27배 가량 검출되었 다. 관수주기에 따라서는 ed, 7d, 3d 순으로 유의하게 나타났 다. K+은 100, 200, 0mM NaCl 처리구 순으로 유의하게 나 타났으며 관수주기에 따라서는 3d가 7d, ed에 비해 유의하게 높게 나타났다. Ca2+와 Mg2+ 는 모두 NaCl 농도에 따라서 100, 200, 0mM 처리구 순으로, 관수주기에 따라서는 3d, 7d, ed 순으로 유의하게 나타났다.

    고 찰

    본 실험에서는 관수주기 및 NaCl 농도에 따른 산오이풀의 생육, 광합성 형광 변수, 항산화 효소, 엽록소 함량, 무기이온 이 측정 및 분석되었다. 본 실험에서 분석된 광합성 형광 변수 중 하나인 Fv/Fm은 스트레스 반응을 확인하기 위해 주로 측 정되며(Baker 2008), 대략적인 최적값 범위는 많은 식물 종 에서0.79~0.84로 여겨지고 값이 낮을수록 식물이 강한 스트 레스를 겪는 다는 것을 의미한다(Kalaji et al. 2017). 염 스 트레스를 받은 산오이풀은 NaCl의 농도, 관수주기에 관계없 이 2주차까지 Fv/Fm이 0.79 이상이었지만, 4주차에서는 NaCl 처리구에서 유의한 감소를 보이며 0.79 이하로 감소하 였다. 이는 스트레스에 의해 2주 이후부터 광합성 기구의 급 격한 이상 반응이 나타났기 때문으로 보인다.

    일반적으로 NPQ는 NaCl 농도가 증가함에 따라 증가하는 경향이 나타나는데(Acosta-Motos et al. 2017), 본 실험에 서는 4주차에 Fv/Fm과 함께 급격한 감소가 나타났다. 과도한 여기 에너지가 열로 방출되는 값을 나타내는 NPQ는 식물의 광 이용에 있어서 과도한 에너지로부터 세포를 보호하는데, 스트레스 환경에서 식물의 광합성 능력 저하에 따라 더 많은 에너지를 열로 방출시키게 된다(Müller et al. 2001). 하지만, 일부 염 스트레스에 민감한 식물들에서 염 스트레스에 따른 qP(photochemical quenching coefficient), ETR(electron transport rate) 뿐 아니라 NPQ의 감소도 보고되었으며, 이 는 염 스트레스에 의해 엽록체 파괴, 틸라코이드 막 이상 등을 포함한 식물의 주요 생리적 기능이 붕괴되어 나타난 현상으로 여겨진다(Lee et al. 2013;Shu et al. 2013).

    식물이 염으로부터 받는 스트레스는 시간에 따라 급격한 초 기 반응과 점진적인 후기 반응으로 나뉜다. 초기의 반응인 삼 투적 영향은 Na+가 잎에 축적되어 독성을 보이기 전에 뿌리 외부의 삼투압 증가로 인해 급격하게 나타나고 후기의 반응은 Na+가 잎에 축적됨에 따른 이온 독성 반응으로 인해 점진적으 로 나타난다(Munns and Tester 2008;Munns et al. 1995;Yeo et al. 1991). 본 실험에서 분석된 Fv/Fm에 따르면 2주 까지 유의한 감소가 나타나지 않았으므로 흔히 염 처리 이후 초기에 나타나는 삼투 스트레스에 의한 영향은 적었던 것으로 보인다. 그러나 2주 이후 급격한 Fv/Fm 값 감소는 Na+의 축 적에 따른 이온 스트레스로 인한 것으로 보이며, 생육불량으 로 인해 고사가 나타난 것으로 보인다. 본 연구에서는 엽록소 형광 분석을 2주마다 실시하여 스트레스에 대한 산오이풀 반 응의 시간적 흐름을 구체적으로 파악할 수 없었다. 향후 더 짧 은 간격의 엽록소 형광 분석을 통해 산오이풀의 염 스트레스 에 대한 초기 반응과 후기 반응을 구체적으로 분류하고 이를 분석하는 연구가 필요할 것으로 보인다.

    건조 스트레스에 대한 산오이풀의 반응을 조사하기 위해 관 수주기에 의해 토양수분함량이 조절되었다. 건조 스트레스 하 에서 식물의 Fv/Fm 감소는 여러 선행 연구를 통해 보고되어 왔다(Guang-Cheng et al. 2011;Jefferies 1992a, b;Li et al. 2008;Yuan et al. 2016). 본 실험에서는 NaCl을 처리 하지 않았을 때 관수주기에 관계없이 Fv/Fm이 0.79 이상으 로 정상범위를 유지하였고 모든 개체가 생존했다. 또한, 식물 은 건조 스트레스를 받았을 때 세포내 O2-, H2O2, MDA의 수 준이 증가하게 되는데(Kadioglu et al. 2011), 이로 인한 산 화적 스트레스를 줄이기 위해 SOD, POD 등 다양한 항산화 물질의 수준을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Singh et al. 2015). 그러나 과산화물(MDA), 스트레스 반응(proline), 항 산화물질(SOD, POD), 항산화능(DPPH)를 분석한 결과 관수 주기에 따라 유의한 차이가 나타나지 않았다. 그러나 이러한 결과는 산오이풀이 강한 내건성을 가지고 있기 때문이라고 보 기 어렵다. 일반적인 사질식양토에서 포장용수량은 30%, 영 구위조점은 18%로 알려져 있다(Datta et al. 2017). 또한 식 물 건조 스트레스와 관련된 선행연구에서도 토양수분함량이 30% 이상일 때를 관수처리구 약 20%일 때 건조구로 설정하 였으나(Lee 2018;Lee et al. 2018), 본 실험에서는 모든 처 리구에서 토양수분함량이 거의 모든 기간 동안 40% 이하로 감소하지 않았다. 따라서 산오이풀의 건조 스트레스 반응을 조사하기 위해서는 관수방법이나 관수주기, 관수량, 온도, 상 대 습도 등 환경변수 및 실험에 사용된 센서와 토양수분함량 값을 사용된 토양에 맞게 더 정밀하게 조절 및 보정 후 이용 해야 할 것으로 보인다.

    삼투 스트레스와 건조 스트레스에 대한 식물의 광합성 및 기공전도도 반응은 유사하다. 두 가지 스트레스 반응 모두 근 권부의 수분 생리 이상을 감지하고 abscisic acid(ABA)가 관 여하여 기공을 폐쇄함에 따라 순광합성량이 줄어든다(Fricke et al. 2004;Singh et al. 2015). 삼투 스트레스의 피해는 건조 스트레스를 받지 않을 때 경감될 수 있기 때문에(Munns and Tester 2008) 건조 스트레스와 삼투 스트레스의 반응을 연관 지어 해석했을 때 NaCl을 처리한 산오이풀이 2주까지 삼투 스트레스에 저항하였다는 것을 시사한다. 그러나 7d 처 리구에서 엽록소 함량이 25.8% 가량 유의하게 감소한 것은 관수 처리로부터 악영향이 없지는 않았음을 의미한다.

    식물은 NaCl에 의해 유발되는 이온독성에 저항하기 위해 Na+ 축적을 줄이려고 한다. 이온 스트레스 저항성은 뿌리에 서 Na+의 흡수를 줄이거나 방출하고, 지상부 이동을 억제하 거나 세포내 Na+를 격리하여 나타나게 된다(Munns and Tester 2008). 흡수된 Na+를 다시 세포 밖으로 내보내는 과 정에서 Ca2+가 중요한 역할을 하는데(Zhu 2002), Na+의 농 도가 상승함에 따라 세포내 Ca2+가 증가하게 된다(Kiegle et al. 2000). Ca2+는 calcium-binding 단백질인 SOS3와 결합 후 인산화 단백질인 SOS2과 결합하여 SOS3-SOS2 복합체 를 형성한다(Halfter et al. 2002). 이들이 Na+/H+ 역수송 체인 SOS1을 인산화 시켜 최종적으로 SOS1가 활성화되면 (Quintero et al. 2002;Shi et al. 2002), 세포 내 Na+가 세 포밖으로 방출된다(Munns and Tester 2008;Tracy et al. 2008;Zhu 2002).

    또한 Na+의 세포내 유입에 관여하는 HKT1 단백질의 유형 중 subfamily 2에 해당하는 단백질들은 Na+와 K+를 동시 수 송하는 기능을 한다(Rubio et al. 1995). K+는 식물 생육에 반드시 필요한 무기이온이며, 세포내 이온 독성이 Na+에 비 해 현저히 적기 때문에 Na+보다 K+를 축적하는 것이 염 스트 레스에 저항하는 데 유리할 것이다(Shabala and Pottosin 2014). 따라서 HKT1 subfamily 2 단백질에 의한 Na+ 수송 은 K+/Na+ 비율을 높이며 식물에게 이온 스트레스에 대한 저 항성을 부여한다(Uozumi et al. 2000).

    본 연구에서 수행된 무기이온 분석의 결과는 100mM 3d, 7d 처리구에서 Ca2+, K+가 많고 Na+가 적은 것으로 보아 이 온 스트레스에 대한 저항성을 보였다는 것을 확인할 수 있다. 그러나 더 자주 NaCl 처리를 하거나 NaCl의 농도가 높았을 때 이러한 저항성 기작이 발현되지 않았다. 이는 Na+농도의 급격한 증가로 인한 이온 스트레스에 산오이풀이 대처하지 못 했거나 이러한 저항성 메커니즘이 붕괴되었기 때문으로 보인다.

    본 연구는 관수주기 및 NaCl 농도를 조절하여 건조 및 염 처리에서 산오이풀의 반응을 관찰하고자 했다. 관수주기에 따 른 반응은 엽록소 함량 감소를 제외한 모든 분석에서 유의성 이 나타나지 않았으므로 건조 스트레스가 유도되지 않은 것으 로 보이며 건조조건 조성 방법을 변경하여 추가 연구가 필요 하다. 모든 처리구에서 2주까지 유의한 스트레스 반응이 나타 나지 않았으므로 산오이풀은 NaCl에 의해 초기에 발생하는 삼투 스트레스에서 강한 저항성을 갖고 있으나 이온 스트레스 에 의해 2주 이후 생육 불량 및 고사가 급격하게 나타났다. 산 오이풀은 Na+의 축적을 방지하기 위해 Na+을 세포 외부로 방 출하고 K+와 함께 수송하여 세포 내 Na+ 농도를 낮추는 것으 로 보인다. 그러나 엽록소 형광 분석 주기가 길고 시간에 따른 성분, 무기이온에 대한 분석이 수행되지 않았기 때문에 염 스 트레스에 대한 산오이풀의 구체적인 반응 변화를 관찰할 수 없었다. 따라서 염 스트레스에 대한 생육 한계 범위, 성분 변 화 및 이온 축적과 이온 스트레스에 대한 저항이 어떠한 방향 으로 나타나는지 밝히기 위해 NaCl의 농도를 세밀하게 설정 하여 시간에 따른 변화를 관찰하기 위한 분석 등 향후 연구가 수행되어야 한다.

    사 사

    본 연구는 국립수목원 ‘야생화 산업화를 위한 활용도 다변 화, 연중재배 및 개화조절 기술 개발(KNA1-2-33, 17-8)’ 과 제의 지원에 의하여 수행되었음.

    Figure

    FRJ-31-4-364_F1.gif

    Changes in substrate water content (A) and substrate EC (B). ED: irrigation every day; 3D: irrigation every 3 days; 7D: irrigation every 7 days; 0 mM: 0 mM NaCl treatment; 100 mM: 100 mM NaCl treatment; 200 mM: 200 mM NaCl treatment.

    FRJ-31-4-364_F2.gif

    Changes in survival rate of Sanguisorba hakusanensis according to different NaCl concentration during 4 weeks (from second week to fifth week). 100 mM = 100 mM NaCl treatment; 200 mM = 200 mM NaCl treatment; ED = irrigation every day; 3D = irrigation every 3 days; 7D = irrigation every 7 days.

    FRJ-31-4-364_F3.gif

    Changes in Fv/Fm (A, C, and E) and nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching (NPQ, B, D, and F) measured every 2 weeks to investigate response of Sanguisorba hakusanensis to drought and salinity treatments (From June 29th to August 10th) The measurements were conducted on survived individuals multiple times in treatment groups where individuals withered, and statistical analysis was performed. 0 mM NaCl treatment (A and B); 100 mM NaCl treatment (C and D); 200 mM NaCl treatment (E and F); 0 mM = 0 mM NaCl treatment; 100 mM = 100 mM NaCl treatment; 200 mM = 200 mM NaCl treatment; ED = irrigation every day; 3D = irrigation every 3 days; 7D = irrigation every 7 days. ns, *, **, and ***Non-significance or significance at p ≤ 0.05, 0.01, and 0.001, respectively, by ANOVA (n = 3).

    Table

    Growth characteristics of Sanguisorba hakusanensis according to different irrigation cycle, measured immediately after end of the experiment.

    <sup>z</sup>ED = irrigation every day; 3D = irrigation every 3 days; 7D = irrigation every 7 days.
    <sup>y</sup>Fresh weight / dry weight
    <sup>x</sup>Shoot dry weight / root dry weight
    <sup>w</sup>Values mean standard error (n = 3).
    <sup>ns, *, **, and ***</sup>Non-significance or significance at p ≤ 0.05, 0.01, and 0.001, respectively, by ANOVA (n = 3).

    Fv/Fm and nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching (NPQ) according to different NaCl concentration and irrigation cycle, measured every 2 weeks. The measurements were conducted on survived individuals multiple times in treatment groups where individuals withered, and statistical analysis was performed.

    <sup>z</sup>ED = irrigation every day; 3D = irrigation every 3 days; 7D = irrigation every 7 days.
    <sup>y</sup>Values mean standard error (n = 3).
    <sup>x</sup>No data is available for this treatment group as all individuals withered.
    <sup>w</sup>Statistical analysis was not conducted due to treatment groups where all individuals withered.
    <sup>ns, *, **, and ***</sup>Non-significance or significance at p ≤ 0.05, 0.01, and 0.001, respectively, by ANOVA (n = 3).

    Enzymes and isoenzymes of antioxidant capacity and total chlorophyll contents in Sanguisorba hakusanensis under 0 mM NaCl concentration and different irrigation cycle, measured immediately after end of the experiment.

    <sup>z</sup>ED = irrigation every day; 3D = irrigation every 3 days; 7D = irrigation every 7 days.
    <sup>y</sup>Values mean standard error (n = 3).
    <sup>x</sup>Different letters in table indicate significant difference by Duncun’s multiple range test, <i>p</i> ≤ 0.05 (n = 3).
    <sup>ns, *, **, and ***</sup>Non-significance or significance at <i>p</i> ≤ 0.05, 0.01, and 0.001, respectively, by ANOVA.

    The inorganic component of leaves of Sanguisorba hakusanensis under different NaCl concentration and irrigation cycle, measured immediately after end of the experiment.

    <sup>z</sup>ED = irrigation every day; 3D = irrigation every 3 days; 7D = irrigation every 7 days.
    <sup>y</sup>Values mean standard error (n = 3).
    <sup>x</sup>Different letters in table indicate significant difference by Duncun’s multiple range test, <i>p</i> ≤ 0.05 (n = 3).
    <sup>N</sup>D mean ‘not detected’; < 200 mg·kg<sup>-1</sup>.
    <sup>ns, *, **, and ***</sup>Non-significance or significance at <i>p</i> ≤ 0.05, 0.01, and 0.001, respectively.

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