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ISSN : 1225-5009(Print)
ISSN : 2287-772X(Online)
Flower Research Journal Vol.31 No.4 pp.274-286
DOI : https://doi.org/10.11623/frj.2023.31.4.11

Induction of 2n Gametes in Oriental Lily Hybrids ‘Medusa’ and ‘Marco Polo’ Utilizing N2O Gas
N2O Gas를 이용한 Oriental 백합 ‘Medusa’와 ‘Marco Polo’의 2n Gametes 형성

Song Kyung Park, Yun-Jae Ahn1,2, Yoon-Jung Hwang3, Ki-Byung Lim1,2*
1Department of Horticultural Science, Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea
2Institute of Agricultural Science and Technology, Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea
3Department of Convergence Science, Sahmyook University, Seoul 01795, Korea

박송경, 안윤재1,2, 황윤정3, 임기병1,2*
1경북대학교 원예과학과
2경북대학교 농업과학기술연구소
3삼육대학교 화학생명공학과
Correspondence to Ki-Byung Lim Tel: +82-53-950-5726
E-mail: kblim@knu.ac.kr
27/11/2023 13/12/2023

Abstract


Production of Lily interspecific hybrids have been developed by using various pollination methods. But most of these interspecific hybrids are sterile. To overcome the sterility of interspecific F1 hybrids, 2n gametes are frequently being used. Therefore, we carried out N2O gas treatment for induction of 2n gametes in Oriental hybrid 'Medusa' and 'Marco Polo'. The meiosis stages between 'Medusa' and 'Marco Polo' are quite different although they belong to the same Oriental group. There were two different types of spindles, sequential spindles and tripolar spindles in the tetrad stage of both hybrids. The occurrence of different four types of monad, dyad, triad and tetrad were surveyed from 10 - 15 mm and 20 - 25 mm sized flower bud of 'Medusa' that was treated with 2 atm N2O. However, the formation of tetrad was surveyed from flower buds treated with 4 atm N2O.




백합 종간 교잡종은 다양한 교배 방법에 의해 생산되어지 고 있다. 그러나 이들 종간 교잡종은 대부분 불임이다. 2n gametes는 백합에서 종간 교잡종 F1의 불임을 극복할 수 있 을 뿐 아니라 우수한 유전형질을 지닌 2n과의 교배에 이용할 수 있고 후대 다양한 유전형질을 기대할 수 있다. 따라서 본 실험에서는 가장 효과적으로 2n gametes를 생산할 수 있는 방법을 구축하기 위하여 백합 Oriental hybrids ‘Medusa’와 ‘Marco Polo’에 N2O를 처리하였다. 같은 Oriental 그룹 내 에서도 ‘Medusa’와 ‘Marco Polo’는 화뢰 크기별 감수분열 시기가 달랐다. 감수분열 tetrad 시기에 염색체를 관찰한 결 과 sequential spindles, tripolar spindles에 의해 2가지 다른 형태가 관찰되었다. ‘Medusa’에서 2atm의 N2O를 처리 한 화뢰 길이 10~15mm와 20~25mm에서 monad, dyad, triad, tetrad가 관찰되었다. 그러나 4atm에서는 tetrad 이외에는 검경 되지 않았다. ‘Marco polo’의 경우 화뢰 길 이 10~15mm, 25~30mm 시기에 2, 4atm의 N2O를 12, 24 시간 동안 처리한 구에서 모두 dyad, triad가 관찰되었다. ‘Medusa’, ‘Marco Polo’ 모두 dyad, triad, tetrad가 관찰 된 시기는 대조구에서 interphase와 metaphase Ⅰ에 해당 하는 시기이다. 화분의 모양은 타원형으로 처리 전·후 변화가 없었으며 처리 후 화분의 크기는 n 보다 큰 화분뿐 아니라 작 은 화분도 관찰되어 전체적으로 다양했다. 화분의 임성과 발 아율은 처리구별로 차이가 없었으나 평균적으로 처리 후가 무처리구보다 임성은 약 10%, 발아는 약 20% 정도 떨어졌다. ‘Medusa’와 ‘Marco Polo’를 이용하여 N2O를 처리한 것과 처리하지 않은 것을 정역 교배하였을 때 자방이 비대 되는 형 태가 2가지이었으나 처리 별 차이는 아니었다. 획득된 식물체 를 Flow cytometry로 검정한 결과, 무처리 ‘Marco Polo’와 2atm 24시간 32mm에 처리한 ‘Medusa’의 교배를 통해 하 나의 식물체에서 2배체와 3배체가 모두 나오는 mixoploid를 확인할 수 있었다. 그 외 실험을 통해 얻은 식물체 중에서 이 수체가 4개 발견되었다. 확실한 3배체를 가진 식물체는 관찰 할 수 없었다.


Lilium , meiosis , meiotic polyploidization , nitrous oxide gas , ornamental crops , polyploidy induction

백합 , 감수분열 , 감수분열 세포 배수화 , 아산화질 소 가스 , 관상 작물 , 배수체 유기

초록

    서 언

    백합은 백합과(Liliaceae) 백합속(Lilium)의 다년생 구근으 로 약 100종 이상이 존재하며 Lilium 속은 주로 아시아, 북미, 유럽의 북반구(기온 10~60 ℃)에 분포한다. 최근 새로운 백합 종으로 Lilium zairii은 아프리카에서 발견되었으며 L. eupetes 는 최근 베트남에서 수집되었다(Mynett and Mackiewicz 1985).

    백합은 크게 15가지의 형태학적, 생리학적 특징을 기초로 Martagon, Pseudolirium, Lilium(Liriotypus), Archelirion, Sinomartagon, Leucolirion, Daurolirion 7개 section으로 분류되어 있다(Comber 1949). 이들 중 절화용으로 주로 쓰이는 그룹은 section Archelirion 내 교잡종인 Oriental hybrids와 section Sinomartagon 내 교잡종으로 구성된 Asiatic hybrids 및 section Leucolirion 내의 교잡종인 Longiflorum hybrids의 품종들이다(Lim 2000). Asiatic hybrids는 1950년대 미국에서 개발된 것으로 다양한 화색, 상향 개화, 소구 개화성, 다수의 소화를 가지는 장점을 지닌 다. 일부 품종은 꽃잎에 반점이 있으며 최근 무반점 위주로 품종이 육성되고 있다. Oriental hybrids는 1976년 이후 L. speciosum × L. nobelissimum 과 L. auratum의 교잡이 시 초가 되어 만들어진 그룹이다. 꽃은 bowl 형태로 적색, 분홍, 흰색의 화색을 가지며 향기가 강하다. 그리고 Longiflorum hybrids는 일본의 자생종인 L. longiflorum을 개량한 것으로 흰색의 트럼펫 화형을 지닌 절화 및 분화용이다.

    백합은 다양한 크기의 화경, 단순하고 화려한 화서, 상향, 측향, 하향의 개화방향, 다양한 화색, 초장, 내병성 등의 특성 을 가진다. 이런 특성들의 교잡을 통해 후대에 이입됨으로 신 품종들이 육성되고 있다(Barba-Gonzalez et al. 2008).

    백합의 원종은 대부분 2배체(2n=2x=24)이며 동일 section 내에는 유연관계가 가깝기 때문에 비교적 교잡이 용이하다. 그러나 다른 section에 속하는 품종들이나 원종들 간의 교잡 은 수정 전 장벽과 수정 후 장벽으로 인해 교배가 쉽지 않다. 그래서 이런 어려움을 극복할 수 있는 여러 가지 기술들이 개 발되었다. 수정 전 장벽은 cut-style 수분방법(Asano and Myodo 1977;Myodo 1962), 수분 전 암술대에 열을 가하는 방법(Ascher and Peloquin 1966), 화분에 방사선을 처리하 여 이용하는 ‘mentor pollen’법(Van Tuyl et al. 1988), 암 술대에 호르몬을 처리하는 방법(Ascher 1981) 등으로 해결할 수 있고 수정 후 장벽은 배배양, 배주배양, 자방절단 등의 방 법으로 타파하고 있다(Asano 1982;Van Tuyl et al. 1991). 수정 전·후 장벽에도 불구하고 이러한 기술들로 인해 1960년 이후로 종내·간 교잡으로 9,400여 이상이 품종으로 등록 되 어있다(www.lilyregister.com).

    그러나 이러한 기술들을 적용하여 생산한 종간 잡종은 불임 이라는 또 다른 문제점을 가지고 있어 이의 극복방법을 개발 하는 기술이 매우 중요하다. 종간 잡종 개체의 불임의 원인은 1) 양친 게놈간 유전적 불화합으로 생성되는 유전적인 불임, 2) 염색체의 상동성 부족으로 형성되는 염색체적 불임, 3) 핵 내 유전자와 세포질과의 불친화성으로 형성되는 세포질 불임 이 원인으로 대부분이 방추사 형성 및 세포질 분열, 비정상적 인 염색체 pairing 등의 문제 때문이다(Lim et al. 2005).

    종간 잡종의 불임을 타파하기 위한 방법으로 염색체 배가 법이 사용되어 왔다. 이는 Östergren에 의해 처음 소개된 “spindle poisons”를 이용하는 것으로 이는 세포분열 과정 중 방추사 형성 단계를 방해하는 것으로서 배수화 방법에는 크게 2가지가 있다(Östergren 1955). 체세포 염색체 배가 법(somatic polyploidization)과 생식세포 염색체 배가법 (meiotic polyploidization)이다(Camadro and Peloquin 1980). 체세포 염색체를 배가시키기 위해서 caffeine(Thomas et al. 1997), colchicine(Emsweller 1949), oryzalin(Tosca et al. 1995)이 주로 사용되었다. 체세포 배가법에 의해 생성된 gametes는 유전적으로 다양성이 낮을 뿐 아니라 육종에 적용 하기에는 많은 시간과 노동력이 요구되는 단점이 있다.

    반면, 생식세포 염색체의 배가는 환경의 변화(온도 및 습도 등의 환경적 요인), 방추사 형성 억제제 처리 등으로 비정상적 인 감수분열이 일어나 화분 또는 난세포속의 염색체 수가 n이 아닌 2n으로 형성되는 것이다. 이러한 생식세포 염색체 배가 는 드물지만 자연적으로도 발생하는데, 이러한 2n gametes 의 생성을 Rosenberg가 ‘meiotic nuclear restitution’ 으로 보고하였다(Rosenberg 1927). 자연적으로 발생하는 2n gametes는 대부분 피자식물에서 일어나며 발생되는 2n gametes는 배수체를 만든다(Harlan and de Wet 1975;Ramanna and Jacobsen 2003;Veilleux 1985). Unreduced gametes(2n gametes)는 같은 종 내에서도 다른 기작에 의해 생산될 수 있으며 하나 이상의 기작이 개개 식물에 작용되기 때 문에 정확한 발생 기작을 구명하기 어렵다(Souza et al. 1999;Werner and Peloquin 1991). Veilleux 및 Bretagnolle와 Thompson는 몇 가지 2n gametes를 이끄는 기작에는 비정 상적 감수분열, synaptic mutants, metaphaseⅠ또는 Ⅱ시 기의 방추사 부족 또는 이상, 세포질분열의 문제 등이 있다 고 보고했다(Bretagnolle and Thompson 1995;Veilleux 1985). 대부분 2n gametes의 형성은 metaphaseⅠ 또는 Ⅱ 시기 spindle형성의 실패와 비정상 cytokinesis로 인해 발생 한다(Taschetto and Pagliarini 2003).

    체세포배가(somatic polyploidization)와 생식세포배가 (meiotic polyploidization) 사이에는 차이점이 있다. 체세 포염색체가 그대로 배가된 경우 heterozygosity(이형접합성) 가 고정되지만 meiotic polyploids에서는 고정이 되지 않는 다. 생식세포배가는 염색체의 작은 부분들끼리 재조합이 일어 나 후대에 전달된다(Karlov et al. 1999;Lim et al. 2001;Ramanna et al. 2003). 따라서 meiotic polyploids의 2n gametes는 유전조성이 다양하고, colchicine 등을 체세포에 처리하여 배가한 것 보다 유전적 다양성이 크다(Camadro and Peloquin 1980).

    2n gametes가 생성되는 원인으로 세포질 분열에 기원하 는 기작으로는 First Division Restitution(FDR), Second Division Restitution(SDR)이 Rosenberg에 의해 보고되었 다(Rosenberg 1927). FDR은 제1감수분열 후기 때 제2 감수 분열 후기와 비슷하게 염색체가 나누어지고 세포질 분열이 일 어난다. 그 이후 더 이상의 염색체 분리가 일어나지 않기 때문 에 2n gametes가 생성된다. SDR은 정상적인 감수분열을 거 치다가 제2 감수분열 후기에 세포질 분열이 일어나지 않음으 로 2n gametes가 형성되는 것이다. 유전적으로 FDR은 양친 의 유전형질을 상당히 많이 유지하고 있다. Indeterminate Meiotic Restitution(IMR)은 FDR과 SDR 기작의 특성이 결 합된 형태이다(Lim et al. 2001). 백합의 2n gametes는 대 부분 FDR에 의해 생성되고 드물게 SDR과 IMR에 의해서 생 성되기도 한다(Lim et al. 2001;Lim et al. 2004).

    일반적으로 단자엽식물의 경우 제1 감수분열 후 첫 번째 cytokinesis가 일어나고 2번째 감수분열 후 두 번째 cytokinesis 가 각각 일어나는 successive type이다. 반면 쌍자엽식물 은 감수분열이 끝난 후 1, 2번째 cytokinesis가 동시에 일 어나는 simultaneous type이다. 그래서 단자엽 식물의 경우 cytokinesis가 한번 생략되면 unreduced gametes가 생성 될 수 있다(Pagliarini et al. 1999). Cassava와 Manihot종 (Manihot epruinosa, Manihot glaziovii) 종간 교잡 시(Hahn et al. 1990) 자연적으로 2n gametes가 0.1%~35.6% 생성 되지만 2n gametes자연발생율이 낮은 백합과 같은 경우는 인 위적으로 2n gametes를 생성시키기 위한 연구가 수행되고 있다. 이런 노력은 백합뿐 아니라 튤립에서도 2n gametes 를 인위적으로 생성하기 위한 시도가 있었다(Okazaki et al. 2005).

    생성된 2n gametes를 이용한 육종에는 다음과 같은 이점이 있다. 첫째, 불임인 종간 잡종 F1이 2n gametes를 생산한다면 염색체의 인위적 배가 과정을 생략할 수 있다(Barba-Gonzalez et al. 2006). 둘째, 2배체 종간 잡종에서 homoeologous 염 색체는 어쩔 수 없이 강제적으로 대합되기 때문에 염색체 이 입이 가능하다(Karlov et al. 1999;Lim et al. 2003). 셋째, 생식세포 배수성은 F2와 BC1의 후대에서 유전적으로 훨씬 다양한 형질이 나타날 수 있다(Ramanna et al. 2003). 넷 째, 우수한 형질을 가진 4배체로부터 생성된 2n gametes와 pairing 할 수 있는 2n gametes를 2배체에서 생산할 수 있 다(Akutsu et al. 2007). 2n gametes의 여부는 화분의 크기 나 모양, 후대 배수성 분석, 감수분열시 이분체(dyad)의 존재 여부, 후대의 능력과 임성의 차이 및 동위효소 또는 DNA 표 지인자의 이용으로 확인할 수 있다(Rim 1997). 자연적으로 생성된 2n gametes를 선발하는 것뿐만 아니라 인위적으로 2n gametes를 유도하는 것 또한 어렵다(Barba-Gonzalez et al. 2006).

    따라서 본 연구에서는 백합에서 종간 교잡종 F1의 불임을 극복할 수 있고 우수한 유전형질을 지닌 2n과의 교배에 이용할 수 있는 2n gametes를 생산하기 위하여 N2O gas(Nitrous oxide gas)를 이용하여 백합 Oriental hybrids에 가장 효과 적으로 생산할 수 있는 방법을 구축하기 위하여 실시하였다.

    재료 및 방법

    식물재료 및 N2O(Nitrous oxide) gas 처리

    백합 Oriental hybrids ‘Medusa’와 ‘Marco polo’를 경 북대학교 농대 부속 실험 실습장 온실에 정식하여 재배하였 다. 초장을 조절하기 위해 shoot가 3~4cm 되었을 때 2주간 3차례 Daminozide 200mg‧L-1를 엽면살포 하였다.

    N2O처리는 화뢰 길이 10~40mm의 범위에서 2, 4atm의 기압으로 12, 24, 48시간씩 각각 처리해 주었다. 처리할 화뢰 에는 식물체에 손상이 가지 않도록 지름 0.1mm 정도의 구멍 을 내어 chamber(60x60x100cm)에 넣고 N2O gas를 주입 하였다. 처리가 끝나면 chamber에서 화분을 꺼내어 동일한 온실에서 재배하였다.

    화뢰크기별 감수분열 단계 검경

    무처리구 ‘Medusa’와 ‘Marco Polo’의 화뢰길이별 감수분 열 단계를 알아보기 위하여 10~40mm까지 1mm 간격으로 화뢰를 채취하여 감수분열 단계를 조사하였다. 채취한 화뢰는 Acetic acid:ethanol=1:3 용액에 12시간 이상 상온에서 고 정시킨 후 70% Ethanol 용액으로 옮겨 -20℃ 보관하면서 현 미경하에서 감수분열 단계를 검경하였다. N2O를 처리한 화뢰 도 채취하여 고정시켜 염색체의 변화여부를 현미경으로 관찰 하였다.

    N2O 처리 후의 화분크기 및 임성, 발아율

    N2O 처리한 식물체가 개화하면 화분을 채취하여 임성율과 발아율을 검경하였다. 임성은 Alexander’s solution에 염색 하여 100개의 화분을 3반복으로 하여 조사하였다. 화분 발아 는 sucrose 100g‧L-1, H3BO3 0.02g‧L-1, plant agar 5g‧L-1, pH 5.8로 조성된 화분발아배지에 화분을 묻혀 약 3시간 후 100개를 3반복으로 조사하였다. 화분의 크기는 임성조사를 위해 사용한 슬라이드를 현미경하에서 검경한 후 화분의 길이 와 폭을 직경으로 측정하였다.

    N2O 처리 식물체를 이용한 교배와 후대의 배수성 검정

    N2O를 처리한 ‘Medusa’와 ‘Marco polo’를 모본으로 각 각 N2O를 처리하지 않은 ‘Marco polo’, ‘Medusa’와 교배하 고, N2O를 처리하지 않은 ‘Medusa’, ‘Marco polo’를 모본 으로 각각 N2O를 처리한 ‘Marco polo’, ‘Medusa’와 교배하 였다. 그리고 N2O 처리된 ‘Marco polo’와 ‘Medusa’를 정역 교배 하였다. 교배는 개화 2일 후 부본으로 사용할 화분을 채 취하여 모본의 주두에 수분하였으며 건조와 다른 화분의 유입 을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 캡을 씌웠다.

    비대된 자방으로부터 배 배양과 배주 배양을 통해 기내배양 하여 shoot가 자란 후 Flow cytometry를 통해 배수성을 검 정하였다.

    결과 및 고찰

    화뢰크기별 감수분열 단계 검경

    Asiatic hybrid ‘Mona’로 화뢰길이별 감수분열 단계를 조 사한 결과에 의하면 화뢰의 길이가 15~22mm에서 prophase Ⅰ에서 tetrad가 나타났다(Akutsu et al. 2007).

    Oriental hybrid ‘Medusa’를 화뢰크기별로 감수분열 단 계를 검경한 결과, 화뢰 길이가 21mm에서 전기가 시작되었 으며 30mm 이후에서는 감수분열 전 단계가 완료되어 성숙한 화분만 관찰되었다(Table 1). ProphaseⅠ에서 tetrad까지는 화뢰 길이 21~30mm의 범위에서 나타났다. 개화소요기간이 Oriental group 보다 Asiatic group이 빠르기 때문에 화 뢰의 생장 또한 Asiatic이 빠르게 나타난 것이라 생각된다. ‘Marco Polo’는 ‘Medusa’와 동일한 Oriental group이지 만 ‘Medusa’ 보다 늦은 25mm에서 전기가 시작되어 34mm 이후부터 mature pollen이 나타났다(Table 2). 이는 동일한 그룹 내에서도 품종별로 감수분열 시기가 다르다는 것을 나타 낸다.

    N2O 처리 후 감수분열의 tetrad 시기 관찰

    Dyad는 2개의 2n microspores가 생성되고 triad는 1개 의 2n microspore와 2개의 n microspores를 생성하게 된다. Monad, dyad, triad 형태가 나타나는 원인은 방추사 가 다르게 반응하기 때문이다. 그 기작으로는 sequential spindles와 tripolar spindles이 있다. sequential spindles는 restitutional nucleus가 세포의 중심에서 발생되어 linear triad 형태를 가지므로 2n microspores는 중심에 위치하게 된 다. 그리고 tripolar spindles은 telophase Ⅱ에서 restitutional nucleus를 형성하도록 하여 분극화된 2n microspores가 생성 되게 된다(Taschetto and Pagliarini 2003). 본 실험에서 무 처리구의 경우 tetrad가 관찰되는 시기 sequential spindles, tripolar spindles에 의해 2가지 형태가 모두 관찰되었다. N2O를 처리한 후에도 역시 2가지 spindles에 의해 tetrad 뿐 아니라 triad도 Fig. 1과 같이 나타나는 것을 관찰했다. 그 리고 방추사 이상 등의 원인으로 핵분열은 일어나지 않고 세 포질 분열만 일어나 4개의 세포로 나누어 졌으나 핵은 1개의 세포에만 존재하는 형태도 관찰되었다.

    N2O 처리에 의한 sporads의 검경

    ‘Medusa’에 N2O를 처리한 후 화뢰 길이별로 염색체를 검경한 결과, 무처리구에서는 tetrad가 28mm에서, 처리구는 27mm에서 검경되었다. 그리고 2atm의 N2O를 처리한 10~15mm와 20~25mm에서는 tetrad 뿐만 아니라 monad, dyad, triad가 낮은 빈도이지만 관찰되었다(Table 3, Fig. 2). 이 시기는 무처리구에서 interphase와 metaphase Ⅰ단계에 해당하는 시기이다. 그러나 4atm의 세기에서는 tetrad 이외에 는 검경되지 않았다. 따라서 4atm 보다는 2atm가 2n gametes 를 형성하는데 효과적이라 판단된다.

    ‘Marco polo’의 경우 화뢰가 10~15mm, 25~30mm 시 기에 2, 4atm의 N2O gas를 12 또는 24시간 처리한 모든 구 에서 dyad와 triad가 관찰되었다(Table 4). 이는 ‘Medusa’ 에서 나타난 시기와 동일한 interphase와 prophase Ⅰ에 해 당하는 시기이다(Table 2). Asiatic hybrid에서는 prophase, metaphase Ⅰ-Ⅱ에 N2O를 처리함으로써 2n pollen의 형성 이 가능했지만 가장 효과적인 감수분열단계는 metaphaseⅠ 라 하였다(Akutsu et al. 2007). 그러나 Oriental hybrid를 사용한 본 실험에서는 prophase Ⅰ과 metaphase Ⅰ-Ⅱ뿐 만 아니라 interphase에서의 처리도 2n pollen이 형성될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

    N2O 처리 후의 화분크기 및 임성, 발아율

    Asiatic의 화분의 모양은 무처리구에서는 타원형이었으나 처리후에는 구형으로 변화되었다고 보고된 바 있으나 본 연구 에서 관찰한 결과 Oriental hybrids ‘Medusa’와 ‘Marco polo’의 경우 N2O 처리 후에도 형태는 타원형으로 변함이 없 었다(Akutsu et al. 2007)(Fig. 3).

    ‘Medusa’와 ‘Marco polo’의 무처리군, N2O gas 처리군의 화분 임성과 화분 발아율을 Fig. 4에 나타내었다. ‘Medusa’의 경우 무처리군의 화분 임성은 98%였으며 화분 발아율은 66.7%로 관찰되었다. 2atm을 12, 24, 48시간 처리한 경우 화분 임성이 97.1, 92.1, 89.7%로 나타났으며, 화분 발아율 은 46.7, 32.8, 51.2%로 나타났다. ‘Medusa’품종에 2atm의 N2O gas를 처리하는 경우, 화분 임성 자체에는 큰 영향을 끼치지 않지만 화분 발아율이 다소 감소하였다. 4atm을 12, 24, 48 처리한 시험군에서는 화분 임성이 92.9, 85.2, 86.2% 로 2atm 처리군보다는 감소한 임성을 보였다. 화분 발아율의 경우 32.6, 46.7, 39.0%를 보였다. ‘Marco polo’의 경우 무 처리군의 화분 임성은 98%였으나 2atm을 12, 24, 48시간 처리한 후 화분 임성이 89, 82.6, 77.7%로 감소하여 같은 기 압의 N2O gas를 처리할 때 처리시간이 길어질수록 화분 임성 에 영향을 끼치는 것을 발견하였다. 4atm의 N2O gas를 12, 24, 48시간 처리한 결과 화분 임성은 98, 69.5, 78.1%로 나 타났다. 4atm을 12시간 처리한 결과가 2atm을 48시간 처 리한 시험군보다 임성이 현저히 높으며 무처리군의 화분 임 성과 비슷한 수치로 나타났다. 이는 N2O gas의 기압 자체는 Oriental hybrids의 화분 임성과 화분 발아율에 큰 영향을 끼치지 않는 것을 나타낸다. 화분 발아율은 무처리군에서는 46.3%로 나타났으며, 2atm을 12, 24, 48시간 처리한 경우 31.1, 31.5, 36.4%로 나타났다. 4atm을 12, 24, 48시간 처 리했을 때 화분 발아율은 23.8, 13.6, 36.2%로 나타나, 무처 리군과 비교했을 때 N2O gas처리가 화분 발아율 자체에는 큰 영향을 끼치지 않는 것으로 사료된다.

    ‘Medusa’와 ‘Marco polo’ 두 품종 모두 2atm과 4atm의 N2O gas를 12, 24, 48시간 처리한 경우 화분 임성과 발아율 에 다소 영향을 끼쳤으며, ‘Marco polo’품종이 ‘Medusa’에 비해 화분 발아율이 비교적 낮으며 N2O gas 처리 후 영향을 더 많이 받는 것으로 판단된다.

    N2O 처리 식물체를 이용한 교배와 후대의 배수성 검경

    모본으로 N2O를 처리한 ‘Medusa’와 ‘Marco Polo’는 각 각 N2O를 처리하지 않은 ‘Marco Polo’, ‘Medusa’와 교배하 고, 모본으로 N2O를 처리하지 않은 ‘Medusa’, ‘Marco Polo’ 는 각각 N2O 를 처리한 ‘Marco Polo’, ‘Medusa’와 교배하 였다. 그리고 N2O 처리된 ‘Marco Polo’와 ‘Medusa’는 정역 교배하였다. 교배 후 자방은 가지로 비대된 형태가 양분되었 으나(Fig. 5) 특정 처리에 의해 영향을 미치는 것은 아니었다.

    비대된 자방은 배 배양과 배주 배양을 실시한 결과, 정상적으로 비대된 자방이 비정상적으로 비대된 자방보다 육안으로 보이는 배의 수가 더 많았다(Table 5, 6). 배유만 있는 경우 배주 배양을 수행하였지만 식물체는 얻을 수 없었다. Table 5는 N2O 처리 후 ‘Marco Polo’בMedusa’의 배 배양 및 배주 배양의 결과이고 Table 6은 N2O 처리 후 ‘Medusa’בMarco Polo’의 교배 후 배 배양과 배주 배양결과이다. 무처리 ‘Marco Polo’와 2atm 24시간 32mm에 처리한 ‘Medusa’의 교배를 통한 하나의 식물체에서 2배체와 3배체가 모두 나오는 mixoploid를 확인할 수 있었지만 식물체는 고사하였다(Table 7, Fig. 6). 이외에는 무처리 ‘Medusa’와 2atm 12시간 동안 30mm에 처리 한 ‘Marco Polo’의 교배 등에서 이수체가 2개체 관찰되었다. 그리고 2atm 24시간 동안 23mm에 처리한 ‘Marco Polo’를 모본으로 사용하고 4atm 24시간 동안 17mm에 처리한 ‘Medusa’를 부본으로 사용한 경우와 모본으로 2atm 48시간 동안 20mm에 처리한 ‘Medusa’와 무처리 ‘Marco Polo’의 교배에서 각각 1개의 이수체가 나타났다. 그러나 나머지 대부분은 2배체로 확인되었다. 3배체가 발견되지 않은 것은 2n gametes를 만들어 낼 수 있는 dyad, triad의 형성율이 낮았으며 생성되었더 라도 발아될 가능성이 희박했을 것으로 예상된다. 이는 N2O 처리시 화뢰 안 약이나 암술에 상처를 주지 않도록 하기 위해 뚫은 구멍이 N2O 처리하기에 불충분했기 때문이라 고려된다.

    사 사

    본 연구(특허)는 농촌진흥청 공동연구사업(과제번호: PJ016 66305)의 지원에 의해 이루어진 것임.

    Figure

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    Microsporogenesis after N2O gas treatment with 2 atm for 12 hrs on oriental hybrid 'Medusa'. A: triad resulted from sequential spindles; B: triad resulted from tripolar spindles. Scale bars = 10 μm.

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    Microsporogenesis in oriental hybrid ‘Medusa’ after N2O treatment at 2 atm for 12, 24, 24 hrs treatment. A: monad, B: dyad, C: triad, D: tetrad. Scale bars = 10 μm.

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    The pollen shape and size that untreated and after N2O treatment. A: pollen of untreated 'Medusa', B: pollen of 'Medusa' treated 2 atm for 12 hrs, C: pollen of untreated 'Marco Polo', D: pollen of 'Marco Polo’ treated 2 atm for 12 hrs. Arrows indicate larger pollen than normal ones. Scale bars = 10 μm.

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    Pollen viability and pollen germination rate of ‘Marco polo’ and ‘Medusa’ after N2O treatment.

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    Comparison of ovary growth about 60 days after pollination. A: successfully developed ovary, B: unsuccessfully developed ovary.

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    Flowcytometry results of progenies from reciprocal crosses between untreated or treated ‘Marco polo’ and ‘Medusa’. A: untreated ‘Marco polo’ x untreated ‘Medusa’, B: untreated ‘Marco polo’ x treated ‘Medusa’ (2 atm 24 hrs in 32 mm flower bud). C: untreated ‘Medusa’ x treated ‘Marco polo’ (2 atm 12 hrs in 30 mm flower bud).

    Table

    Observation of meiotic stages of Oriental Hybrid ‘Medusa’ by flower bud sizes.

    Observation of meiotic stages of Oriental Hybrid ‘Marco Polo’ by flower bud sizes.

    Type of microspore at tetrad stage after N2O treatment at different flower bud sizes in Oriental hybrid ‘Medusa’.

    Type of microspore at tetrad stage after N2O treatment at different flower bud sizes in Oriental hybrid ‘Marco Polo’.

    Percentage of Plantlet production after in vitro culture from reciprocal crosses (‘Marco polo’ x ‘Medusa’) using N2O treated plants.

    Percentage of Plantlet production after in vitro culture from reciprocal crosses (‘Medusa’ x ‘Marco polo’) using N2O treated plants.

    The results of crosses between 'Medusa' and 'Marco Polo' after N2O treatment.

    No. of flowers pollinated in every treatment was one.

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