서 언
추산쑥부쟁이(Aster × chusanensis Y. Lim, J.O Hyun, Y.D. Kim & H. Shin)는 국화과(Asteraceae) 참취속(Aster) 에 속하는 다년생 초본식물이며 대한민국 경상북도 울릉군 울 릉도의 특산식물이다(KNA 2020). Lim et al.(2005)은 울릉 도의 참취속을 분류학적으로 검토하는 과정에서 울릉도 추산 에서 섬쑥부쟁이(A. ster pseudoglehnii Y. Lim, J.O Hyun & H. Shin), 해국(A. ster spathulifolius Maxim.)과 유사한 미기록종을 발견하였고 형태학적으로 섬쑥부쟁이와 해국의 동지역성 종(sympatric species)으로 판단하여 신종, 추 산쑥부쟁이로 보고하였다. 그 후 분자마커를 통한 종분화 (speciation)를 연구한 결과, 추산쑥부쟁이는 해국과 섬쑥부 쟁이의 자연교잡종으로 밝혀졌다(Shin et al. 2014). 산림청 국립수목원은 울릉도･독도의 생태적 보전가치를 알리기 위해 추산쑥부쟁이를 포함하는 울릉도･독도에서만 자생하는 특산 식물의 분포정보를 최초로 세계생물다양성정보기구(BGIF)에 등재하였다(KFS 2021).
추산쑥부쟁이는 50~100cm 높이로 자라며 줄기가 굵고 튼 튼하여 바닷가의 바람이 강한 환경에 서도 쉽게 넘어지지 않 는다. 꽃은 9~11월에 줄기와 가지 끝에 10~50개의 연보라색 을 띤 두화(head)가 모여피며 산방꽃차례(corymb)를 이루어 경관용으로 활용하기에 좋다(BDNA 2021;KNA 2020;Lim et al. 2005). 그러나 추산쑥부쟁이는 종자 충실도가 떨어지 고 발아율이 10% 미만으로 매우 낮아 파종부터 개화까지 2년 이 소요되어 실생묘를 생산하기 어렵고 시간이 오래 걸리는 등의 단점이 있다(BDNA 2021). 종자번식의 단점을 보완하고 균일한 개체 생산을 통한 종 보전을 위해서 무성증식을 활용 하는 것이 필요하다. 무성증식법 중 조직배양을 통한 증식은 배지조성 및 배양환경 등 재배를 조절하기 자유롭고 소수의 개체로부터 다수의 개체로 증식할 수 있는 장점이 있다.
조직배양에서 시토키닌은 식물의 분열조직에서 세포분열을 촉진시키며, 신초 유도 및 캘러스 분화 등의 효과가 있어 식물 의 대량증식에 필수적으로 활용되는 식물 호르몬이다(Howell et al. 2003;Osugi and Sakakibara 2015;Perilli et al. 2010;Schaller 2014;Schmülling 2013;Srivastava 2002). 국화과 식물의 대량증식을 위한 캘러스, 신초 유도에는 6-Benzylamino purine(BAP), Thidiazuron(TDZ), Zeatin 등 다양한 시토키닌이 사용되고 있다(Boo et al. 2015;Kher et al. 2014;Lim and Yeoung 1995). 지금까지 추산쑥부쟁 이에 관한 연구는 주로 분류학적 검토에 관한 연구(Lim et al. 2005;Shin et al. 2014)가 주로 진행되었으며, 그 중 조 직배양을 적용한 증식 연구는 이루어진 바가 없다. 따라서 본 연구는 추산쑥부쟁이의 기내 대량증식 및 향후 지속가능한 생 태계 유지에 필요한 개체의 증식과 경관 수종으로서 종 공급 을 위한 대량증식 체계를 확립하고자 절편체 부위별 시토키닌 처리에 대한 캘러스 및 신초 형성 조건을 조사하였다.
재료 및 방법
식물재료
연구에 사용한 식물은 국립백두대간수목원에서 보유하고 있는 추산쑥부쟁이의 액아를 2022년 10월에 채집하여, 70% 에탄올에 5분간 1회, 4% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 2분간 4회 침지하여 표면을 무균 소독하였다. 소독된 액아는 멸균한 증류수로 5회 수세한 후, MS(Murashige and Skoog 1962) 기본배지에 sucrose 30g·L-1, gelrite 4g·L-1를 첨가 하고 pH 5.7로 조정한 멸균 배지에 치상하여 3주 동안 배양 후 식물재료로 사용하였다.
절편체 배양
추산쑥부쟁이 절편체는 배양 3주 후의 조직배양묘에서 줄 기와 잎을 절단하여 사용하였다. 줄기는 정단부를 제외한 눈 을 포함하여 1.5cm의 길이로 절단하여 사용하였고, 잎은 1.5cm×1.5cm의 크기로 절단하여 사용하였다. 각각의 절편 체는 페트리디시(100mm×40mm, SPL, Korea)에 3개 절편 체를 3반복하여 치상하였다. 모든 배양환경은 16/8시간의 명 암조건(60μmol·m2·s)에 25±1°C로 유지되는 항온실에서 배 양하였다.
캘러스와 신초 유도를 위한 시토키닌 처리
시토키닌이 캘러스와 신초 유도에 미치는 영향을 비교하고 자, MS기본배지(sucrose 30g·L-1, gelrite 4g·L-1, pH 5.7)에 BAP, TDZ, 2iP(6-(y,y-Dimethylallylamino)purine), Zeatin 을 각각 3.0mg·L-1 단용 처리하여 페트리디시(100mm×40mm, SPL, Korea)에 80mL씩 분주하여 처리하였다.
조사방법 및 통계처리
추산쑥부쟁이 절편체의 캘러스와 신초 유도 조건을 조사하 기 위해 캘러스와 신초 형성률, 신초 수를 1일 간격으로 4주 간 조사하였다. 캘러스와 신초 형성률 계산은 Park(2021)의 방법에 따라 ‘캘러스와 신초가 형성된 절편체의 개수/배지에 치상한 절편체의 총 개수’의 백분율로 계산하였다. 통계분석 은 SPSS 22(IBM corporation, Armonk, NY, USA)를 이용 하여 일원분산분석(1-way ANOVA)을 실시하였으며, 처리 간 통계적인 유의성은 Duncan의 다중검정(p≤0.05)을 사용 하여 비교하였다.
결 과
캘러스 유도 조건 구명
시토키닌 처리에 대한 추산쑥부쟁이 절편체의 캘러스 유도 조건을 조사한 결과, 줄기 절편체의 경우 TDZ 3.0mg･L-1 처 리구에서 캘러스는 평균 8±0.3일부터 형성되었고(Fig. 1), 캘러스 형성률은 88.9%로 가장 높게 조사되었다(Table 1, Fig. 2B). BAP 3.0mg･L-1 처리구는 캘러스가 평균 15±0.3일부터 형성되었고(Fig. 1), 캘러스 형성률은 66.7%로 조사되었다 (Table 1, Fig. 2A). Zeatin 3.0mg･L-1 처리구는 캘러스가 평균 17±0.3일부터 형성되었고, 캘러스 형성률은 66.7%로 조 사되었다(Table 1, Fig. 2D). 2iP 3.0mg･L-1 처리구는 캘러스 가 평균 29±0.3일부터 형성되어 가장 느린 것으로 조사되었고 (Fig. 1), 캘러스 형성률은 11.1%로 가장 낮게 조사되었다 (Table 1, Fig. 1, Fig. 2C). 잎 절편체의 경우 모든 처리구에 서 캘러스가 형성되지 않았으며, 배양 1주 이후부터 절편체 본연의 색을 잃고 탈색(decoloration)현상을 보이며 고사하 는 것을 관찰하였다(Fig. 2E, F, G, H).
신초 유도 조건 구명
시토키닌 처리에 대한 추산쑥부쟁이 절편체의 신초 유 도 조건을 조사한 결과(Table 1), 줄기 절편체의 경우 TDZ 3.0mg･L-1 처리구에서 신초는 평균 11.0±0.6개, 총 99개로 가장 많이 형성되었고, 신초 형성률은 100%로 가장 높게 조 사되었다. BAP 3.0mg･L-1 처리구는 신초가 평균 10.8±0.6 개, 총 97개 형성되었고, 신초 형성률은 88.9%로 조사되었다. Zeatin 3.0mg･L-1 처리구는 신초가 평균 9.9±0.3개, 총 89 개 형성되었고, 신초 형성률은 100%로 조사되었다. 2iP 3.0mg･L-1 처리구는 신초가 평균 3.3±0.2개, 총 30개로 가 장 적게 형성되었고, 신초 형성률은 77.8%로 가장 낮게 조사 되었다. 한편, TDZ 3.0mg･L-1 처리구는 평균 4±0.3일부터 신초가 형성되기 시작하여 처리구 중 가장 빠른 반응을 보였 으나, 신초의 형태가 부풀어 오르거나(swollen shoot) 잎 표 면에 주름이 생기는 기형(abnormal leaf morphology)의 형 태를 보이며, 과수화(hyperhydricity) 현상이 관찰되었다(Fig. 5). 특히, 일부 처리구에서 부정근이 관찰되었는데(Table 2), 2iP 3.0mg･L-1에서는 부정근이 평균 2.4±0.2개로 가장 많 이 형성되었고, Zeatin 3.0mg･L-1에서 평균 0.2±0.2개 형성 되는 것으로 조사되었다. 잎 절편체의 경우 모든 처리구에서 신초가 형성되지 않았다(Fig. 2E, F, G, H).
고 찰
추산쑥부쟁이의 기내배양 시 절편체의 종류와 시토키닌 종 류가 캘러스 및 신초 형성에 미치는 영향에 관하여 조사한 결 과, 잎 절편체는 모두 고사하여 줄기 절편체를 사용하는 것이 효과적인 것으로 확인되었다. 줄기 절편체의 TDZ 3.0mg･L-1 처리구에서 캘러스 유도가 빠르고 형성률도 약 90%로 높았으 며, 신초 발생 또한 100%, 11.0±0.6개로 다른 처리구에 비 해 높게 나타났다.
Boo et al.(2015), Lim and Yeoung(1995)은 참취의 캘 러스 및 신초를 유도하기 위해 잎, 잎자루, 뿌리, 줄기 절편체 를 사용하였다. 잎을 포함한 다양한 절편체에서 시토키닌을 처리하였을 때 캘러스가 유도되지 않거나 미비하였으며 이는 본 연구 결과와 유사하였다. 반면, 소량의 시토키닌과 옥신계 식물생장조절제 NAA를 첨가할 경우 캘러스 유도에 효과적이 었다고 보고되어 추후 NAA와 같은 옥신을 함께 첨가하여 증 식 효과를 분석하는 연구가 필요할 것이다.
본 연구에서 사용한 시토키닌 중 BAP, 2iP, Zeatin은 아데 닌 유도체형(adenine-type) 시토키닌이고 TDZ는 페닐요소 유도체형(phenyl urea-type) 시토키닌이다. 페닐요소 유도 체형 시토키닌은 아데닌 유도체형보다 상대적으로 높은 활 성을 나타낸다(Lu 1993;Murthy et al. 1998;Schmülling 2013). 반면에, 페닐요소 유도체형인 TDZ는 기내배양에 활 용 시 국화과를 비롯한 많은 분류군에서 형태적 기형이 일 어난다(Dewir et al. 2018;Kher et al. 2014;Lim and Yeoung 1995;Lu 1993). TDZ는 분화된 신초의 과수성, 비 정상적인 잎의 형태, 짧고 발달이 저해된(stunted) 신초, 신초 기부가 부풀어 오르는 현상 등 형태적 기형을 유발한다(Dewir et al. 2018;Lu 1993). 특히 1cm 미만의 크기로 자라는 발 달이 저해된 신초의 경우 계대배양 시 신초를 개별로 분리하 는 작업시간이 늘어나는 단점이 있었다(Dewir et al. 2018). 국화과 참취의 마디 절편체에서 신초를 유도하는 과정에서 TDZ 2.0mg･L-1를 단독 처리하였을 때 성장이 저조하고 기형 적인 성장이 나타났다(Lim and Yeoung 1995). 국화과 식물 인 Pluchea lanceolate의 마디 절편체로부터 신초를 유도하는 과정에서도 TDZ 0.5~2.5mg･L-1 단용처리가 BAP, 2iP 보다 신초 발생 수가 많았으나 과수화 현상이 나타났다(Kher er al 2014). 본 연구에서도 TDZ 처리 시 높은 활성은 확인하였으 나 신초에서 형태적 기형이 나타나는 것이 확인되어(Fig. 5) 이전 보고와 동일한 결과를 확인하였다.
Dewir et al.(2018)는 TDZ로 유도된 비정상적인 신초를 해 결하기 위해서는 TDZ의 농도를 0.1mg･L-1 이하로 낮춰 사용 하고 배양기간을 4주 이하로 줄이며 2차 배지로 계대배양하는 것을 제안하였다. 2차 배지는 식물생장조절제를 첨가하지 않 은 배지를 활용하거나 아데닌 유도체형 시토키닌 또는 다른 식물호르몬과 혼용하여 처리하는 것을 제안하였다. Lim and Yeoung(1995) 또한 참취마디 절편체에 TDZ 0.2mg･L-1의 저농도와 NAA 0.5mg･L-1를 혼용처리 하였을 때 정상적인 신 초를 유도할 수 있었다고 보고하였다.
Kim et al.(2015), Chandler and Draper(1986)은 Zeatin 이 BAP, 2iP 등 다른 아데닌 유도체형 시토키닌 보다 신초 형성률이 높고 2iP 보다 신초 증식에 2~4배 효과적이라고 보 고하였다. 본 연구에서도 Zeatin 3.0mg･L-1 처리구는 신초와 잎의 형태적 기형이 없으며 일반적인 추산쑥부쟁이의 잎의 형 태를 보이는 동일한 결과를 나타내는 것으로 조사되었다. 이 상의 결과를 종합하면 균일한 개체의 추산쑥부쟁이를 대량생 산하기 위해서 기내배양을 통한 캘러스 및 신초 유도에는 줄 기 절편체를 사용하고 아데닌 유도체형 시토키닌인 Zeatin 3mg･L-1을 활용하는 것이 적정한 것으로 사료된다.
