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제비붓꽃(Iris laevigata)은 붓꽃과에 속하는 식물로, 한국, 중국, 일본, 러시아의 연못, 개천, 강가 진흙에서 자라는 다년 생 식물이다. 5월에서 6월까지 약 12cm 지름의 보라색 꽃이 펴서 매우 높은 관상적 가치를 지니고 있다(NKISBS 2016). 붓 꽃과 식물은 전세계적으로 북반구에 200여 종 이상 널리 분포 하고 있다(Kim et al. 2004;Park 2004;Park et al. 2002). 그 중 11종 이상이 한반도에 자생한다고 알려져 있다(Kim et al. 2004;Lee 1985;Lee 1996;Park 2004). 붓꽃속 식물은 관상용 식물의 육종 소재로 매우 가치가 높을 뿐만 아니라 약용소재 로의 활용도 가능한 다양한 가치를 지닌 식물이다(Kim et al. 2004;Purev et al. 2002;Rahman et al. 2002, 2003, 2004). 그 중에서도 제비붓꽃은 산림청 지정 희귀식물로 위기종 등급 으로 지정되어 있다(KNA 2021). 또한, 환경부에서도 멸종위 기 야생식물 2급으로 지정되어 있는 보존이 필요한 식물이다 (Kim et al. 2013).
식물의 대량증식 방법 중 실생번식법의 경우 단시간에 다량 의 개체를 확보할 수 있고 많은 노동력을 필요로 하지 않는다 는 장점이 있고, 모본과 부본의 유전자가 혼합되어 유전다양 성이 증가한다는 장점이 있지만 종자의 휴면을 타파해야 하는 단점을 가지고 있다(Ko et al. 2017;Lee et al. 2012;Ryu et al. 2017). 종자의 휴면이란 종자가 선호하는 환경에 놓였 을 때 발아되는 것을 막는 작용을 말한다(Finch-Savage and Leubner-Metzger 2006). Baskin and Baskin(2004, 2014)의 논 문에 따르면, 종자의 휴면은 그 특성에 따라 크게 생리적휴 면(physiological), 형태적휴면(morphological), 형태생리적 휴면(morphophysiological), 물리적휴면(physical), 조합휴면 (combinational)과 같이 5가지로 분류하고 있다. 이러한 휴면 들은 각각 그 휴면의 깊이에 따라 더욱 세부적으로 나눠지게 되며, 식물 분류군에 따라 다른 유형을 가진다고 보고하였다 (Baskin and Baskin 2003, 2004;Baskin and Baskin 2014).
지금까지 연구에 따르면 대부분의 붓꽃속 식물은 형태생리 적휴면(morphophysiological dormancy: MPD)을 가지고 있 는 것으로 알려져 있으며, 그 예로 I. angustifolia(Coops and van der Velde 1995), I. pseudacorus(Grime et al. 1981), I. versicolor(Shipley and Parent 1991), I. virginica(Morgan 1990)등이 있다. 형태생리적휴면은 종자가 미숙배를 가지고 있 는 형태적휴면인 동시에 생리적휴면을 가지고 있는 휴면유형 이다(Baskin and Baskin 2004). 형태생리적휴면은 휴면의 깊이 에 따라 non-deep simple, intermediate simple, deep simple, deep simple epicotyl, deep simple double, non-deep complex, intermediate complex, deep complex, and non-deep simple epicotyl과 같이 9가지로 분류되고, 이러한 분류의 각 특징에 따라 종자의 휴면타파와 발아 방법이 달라진다(Baskin and Baskin 2004;Baskin et al. 2008). 그러나, 지금까지 한반도 자생 Iris속 식물에 대한 휴면 유형 분류 연구는 수행된 적이 없었다.
식물의 보존과 증식, 더 나아가 산업화의 재료로서 활용하 기 위해서는 원하는 시기에 원하는 양의 균일한 묘를 생산할 수 있는 대량증식법 개발이 필수이다. 본 연구는 제비붓꽃의 종자휴면 유형을 분류하고 발아조건을 밝혀냄으로써 제비붓 꽃의 자생지 복원, 현지외 보전을 넘어 산업화 소재로 활용하 기 위한 대량증식법을 개발하기 위해 수행하였다.
재료 및 방법
실험재료
본 연구는 대한민국 양평군에 위치한 국립수목원 유용식물 증식센터(37°48'S, 127°60'E)에서 실시되었다. 연구에 사용된 제비붓꽃(I. laevigata) 종자는 국립수목원 종자은행에서 분양 받아 사용하였다. 이 종자는 강원도 고성군 죽왕면 공현지리 409(GPS: 38°21"27.71, 12°83"01.55)에서 수집한 것이다. 종자 의 겉모습과 내부는 USB 현미경(AM 3111 Dino-Lite premier, AnMo Electronics Co., Taiwan)을 활용하여 촬영하였으며, 종 자 내・외부 형태조사를 위하여 면도칼(Dorco, Seoul, Korea) 로 종자를 반으로 자른 후 관찰 및 촬영을 하였다. 종자의 백 립중은 2.889 ± 0.014g으로 충실한 종자를 사용하였다.
수분흡수 실험
제비붓꽃 종자의 물리적휴면 유무를 알아보기 위하여 수분 흡수 실험을 수행하였다. 90mm × 15mm Petri dish에 filter paper 2장을 깔고 증류수를 추가한 다음 건조된 종자를 100립 3반복으로 처리하였다. 초기 건조종자 무게를 측정하고 3, 6, 9, 12, 24, 48시간 단위로 무게를 측정하였다. 배양시 일장은 16/8h이었고, 광도는 25μmol・m-2 ・s-1로 유지하였다. 종자의 무게 변화량은 %Ws=[(Wh-Wi)/Wi]×100의 공식을 이용하여 계산하였다. Ws=초기 건조종자의 무게 대비 증가된 종자의 무게, Wh=시간에 따른 종자의 무게, Wi=초기 종자의 무게 (Ko et al. 2017).
종자의 소독과 배양
실험에 들어가기 전, 종자의 표면을 소독하기 위하여 소독제 (Benomyl, FarmHannong, Seoul, Korea)를 사용하여 소독을 실시하였다. 소독제는 1,000mg・L-1의 농도로 조제를 하였고, 24 시간동안 종자를 침지 후 증류수로 3회 세척하였다. 그 후 filter paper 2장이 깔린 90mm × 15mm Petri dish에 처리별로 20립 3반복으로 파종하였다. GA3 처리와 저온층적처리는 처리 후 25℃ 식물배양상(Multi-Room Incubator, WiseCube, Wonju, Korea)에서 16/8h(light / dark)의 광주기로 130μmol・m-1 ・ss-2의 광도에서 배양하며 발아 유무를 확인하였다. 배양도중 미생물이 발생할 경우 소독제(Benomyl, FarmHannong, Seoul, Korea)를 1,000mg・L-1의 농도로 조제하여 24시간 동안 다시 침지하여 소 독하였다. 종자의 발아는 유근이 1mm 이상 자랐을 때를 기준으 로 판단하였고, 1주 단위로 발아율을 측정하였다. 발아된 종자 는 바로 제거하여 다른 종자에 영향을 미치는 것을 방지하였다.
고온층적처리와 저온층적처리
저온층적처리를 하기 위하여 종자를 filter paper(Whatman No.1, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 2장이 깔린 90mm × 15mm Petri dish에 파종 후 증류수로 수분을 공급하 여 parafilm(Bemis Flexible Packaging, Neenah, WI 54956, USA)으로 감았다. 종자가 파종된 90mm × 15mm Petri dish를 4℃로 설정된 식물생장상(Multi-Room Incubator, WiseCube, Wonju, Korea)에서 0, 4, 8, 12주 동안 배양한 다음 25℃로 옮겨서 발아율을 측정하였다.
고온층적처리 후 저온층적 실험을 수행하기 위하여 위와 같 은 방법으로 파종된 종자를 25℃로 유지되는 식물생장상에서 8주동안 배양 후 4℃ 식물생장상으로 옮겨 0, 4, 8, 12주 동안 저온층적처리 하였다. 저온층적처리가 끝난 후 다시 25℃ 식 물생장상으로 옮겨서 발아율을 측정하였다.
GA3 처리에 의한 효과
건조 보관 중인 종자를 0, 10, 100, 1000mg・L-1의 GA3 용액 에 24시간동안 침지 후 filter paper(Whatman No.1, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 2장이 깔린 90mm × 15mm Petri dish에 파종하였다. 증류수를 이용하여 수분을 공 급한 후 parafilm(Bemis Flexible Packaging, Neenah, WI 54956, USA)으로 감아서 25℃ 식물생장상에서 배양하며 발아 율을 측정하였다.
통계분석
실험의 결과는 SAS(version 9.2; SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석(ANOVA)을 하였다. 또한, 처 리의 평균간 통계적인 유의성은 Tukey’s honestly significant difference test(p<0.05)를 사용하여 검정하였다.
결과 및 고찰
종자의 휴면은 종자가 가지고 있는 고유의 특징으로 각각의 종자는 발아할 수 있는 적정 환경이 정해져 있으며, 각각의 고 유한 특성을 가지고 있다(Finch-Savage and Leubner-Metzger 2006). 종자의 휴면은 크게 5가지로 나눌 수 있는데, 그 특성 에 따라 물리적휴면(physical dormancy: PY), 생리적휴면 (physiological dormancy: PD), 형태적휴면(morphological dormancy: MD), 형태생리적휴면(morphophysiological dormancy: MPD), 조합휴면(combinational dormancy: PY+PD)으로 나누 어진다(Baskin and Baskin 2004). 물리적휴면은 종피 또는 과 피로 인하여 수분이 흡수되지 않기 때문에 발생하는 휴면이다 (Baskin et al. 2000;Baskin 2003;Baskin and Baskin 2004). 일반적으로 건조 종자 중량대비 24시간 안에 무게 증가율이 20%이상이면 물리적휴면이 없는 것으로 간주한다(Baskin and Baskin 2003). 제비붓꽃 종자의 수분흡수 실험결과 24시간 경 과 후 무게 증가율이 79.0 ± 2.4%였기 때문에 물리적휴면은 없는 것으로 판단하였다(Fig. 1).
종자가 모체로부터 탈리되는 시점에 미숙배를 가지고 있다 면 형태적휴면이 있는 것으로 판단한다(Baskin and Baskin 2004). 종자가 모체로부터 탈리된 후 발아하기 직전까지 배의 추가적인 신장이 필요하다면 미숙배로 판단한다(Baskin and Baskin 2004). 제비붓꽃 종자의 경우 초기 배의 길이가 2.82 ± 0.11mm, 발아직전 배의 길이가 3.61 ± 0.10mm로 배의 길 이가 커진 것을 알 수 있다(Figs. 4, 5). 따라서 제비붓꽃 종자 는 미숙배를 가지고 있으며, 형태적휴면을 가지고 있는 것으 로 판단하였다. 이는 붓꽃과 식물의 일부가 형태적휴면을 가 지고 있다고 알려진 것과 동일하다(Jones and Kate 2014).
종자의 생리적휴면은 가장 일반적인 휴면으로(Baskin and Baskin 2004) 배의 생리적 단계와 종피, 배유 등에 존재하는 호르몬 등의 조성에 의해서 발생한다(Baskin and Baskin 2014). 생리적휴면은 크게 deep PD, intermediate PD, non-deep PD 로 분류할 수 있으며(Nikolaeva 1969), deep PD의 경우, 휴면 이 타파되기 위하여 저온층적처리가 필요하고, GA3처리로는 휴면이 타파되지 않는 특징을 가지고 있다(Baskin et al. 2005). Non-deep PD의 경우 종에 따라 저온 혹은 고온층적처 리로 휴면이 타파되며, 휴면타파에 걸리는 기간이 짧은 특징 을 가지고 있다(Baskin et al. 2005). Intermediate PD는 고온 층적처리 또는 저온층적처리를 하여 타파할 수 있으며, 저온 층적처리를 2∼3개월 동안 상대적으로 긴 기간 처리할 경우 휴면을 타파할 수 있다(Baskin et al. 2005). 제비붓꽃 종자의 발아실험 결과 저온층적처리를 하지 않을 경우 16주동안 전혀 발아가 일어나지 않았기 때문에 생리적휴면을 가지고 있다고 판단하였다(Fig. 2). 제비붓꽃 종자의 발아특성을 살펴보면 5℃에서 0, 4, 8, 12주 동안 저온층적처리 후 25℃조건으로 바 꿀 경우 온도변화 1주 후 각각 0, 11.7, 43.4, 51.7%의 발아율 을 보였다(Fig. 2). 따라서 제비붓꽃 종자의 휴면은 생리적휴 면과 형태적휴면이 모두 존재하는 형태생리적휴면으로 분류 할 수 있다.
형태생리적휴면은 미숙배를 가지고 있으면서 동시에 생리적 휴면을 가지고 있을 경우를 말한다(Baskin and Baskin 2004). 형태생리적휴면은 휴면타파에 필요한 온도요구, 배가 자라는 온도, GA3에 의해 휴면타파 여부, 배축휴면 여부 등을 기준으로 9가지 세부 그룹으로 나눌 수 있다(Baskin and Baskin 2014). 9가지 세부 그룹은 배가 자라는 온도를 기준으로 상대적 고온 에서 배가 자랄 경우 simple MPD, 저온에서 배가 자랄 경우 complex MPD로 구분한다(Baskin and Baskin 2014;Hidayati et al. 2000). 또한, 형태생리적휴면에 포함된 생리적휴면의 단 계에 따라 non-deep MPD, intermediate MPD, deep MPD로 나누어진다(Baskin and Baskin 2014;Hidayati et al. 2000). 제비붓꽃 종자의 경우 미숙배를 가지고 있고, 8주동안 25℃에 서 고온처리 후 각각 0, 4, 8, 12주 동안 4℃의 저온층적처리 기간을 거친 다음 다시 25℃로 옮길 경우 저온처리 기간에 따 라 0, 51.7, 85.0, 88.3%의 높은 발아율을 보이는 것을 알 수 있다(Fig. 3). 또한, GA3처리로는 휴면이 타파되지 않았기 때 문에 deep simple MPD로 보인다. Deep complex MPD로 판 단하지 않은 이유는 저온처리 이전에 고온처리를 통하여 발아 율이 향상되었기 때문에 고온이 포함된 처리에서 배가 자라거 나 휴면이 깨진다고 판단을 하였고, GA3를 통하여 휴면이 얕 아지거나 깨지지 않았기 때문에 deep complex MPD는 아닌 것으로 판단하였다.
지금까지 붓꽃속 식물의 종자 휴면연구는 다양한 지역에 서 이루어져왔다. Table 1과 같이 미국 동부에 자생하는 I. missouriensis, 미국서부에 자생하는 I. versicolor와 I. tenax, 유럽, 북아프리카에 자생하는 I. pseudacorus 등 세계 각지에 자생하는 붓꽃속 식물 종자 휴면 연구 결과 모두 형태생리적휴면에 속하는 것으로 알려져 있다(Baskin and Baskin 2014;Jones and Kate 2014). 또한, I. shrevei, I. lactea, I. angustifolia, I. virginica 등 다양한 붓꽃속 식물 종자의 휴면 유형도 모두 형태생리적휴면으 로 알려져 있다(Baskin and Baskin 2014). I. tenax의 경우 고온처 리가 없을 경우 저온처리를 한다 해도 거의 발아하지 않는 경향을 보였으며, 고온처리 4주 후 저온 8주 처리했을 경우 80%이상 발아하였다(Jones and Kate 2014). 본 연구를 통하여 한국을 포함한 아시아에 자생하는 제비붓꽃 역시 다른 지역의 붓꽃속 식물과 같이 형태생리적휴면을 가지고 있는 것으로 판단된다. 이러한 결과는 붓꽃속 식물의 경우 지역적, 기후적 환경에 따른 진화의 과정에서 종자의 휴면유형은 크게 달라지지 않고 잘 유지되 었으며, 현재 가지고 있는 휴면 유형인 형태생리학적휴면이 붓꽃 속 식물이 생존하는데 적합한 유형임을 추론할 수 있다. 식물은 일반적으로 개체단위에서 이동할 수 없기 때문에 본연의 형질을 유지하는 것과 유전적 다양성을 유지하는 것의 균형을 잘 맞춰야 생존할 수 있다. 붓꽃속 식물의 경우 현재의 종자 휴면유형을 유지하는 것이 지금까지의 생존에 유리하므로 휴면유형의 변화 없이 MPD로 유지한 것으로 보인다.