서 언

수국은 수국과(Hydrnageaceae) 수국속(Hydrangea)에 속하 는 낙엽관목 식물이며, 크고 화려한 화색과 화형으로 절화, 분 화 뿐만 아니라 정원용으로도 전세계적으로 인기있는 식물이 다. 수국은 2014년 미국 원예시장에서 두번째로 인기있는 낙 엽관목 식물로 1,500개 이상의 미국 묘목장에서 생산되어지고 1,000만개 이상의 식물이 판매되어 미국 전체 연간 관목 판매 ($676.6백만, 약 7,808억원)의 13.5%($91.2백만, 약 1,052억원) 를 차지하고 있다(Owen et al. 2016). 한국에서는 절화, 분화 및 정원용으로 많은 인기가 있으며. 절화는 2020년 연간 45만 본이 거래되었으며 거래량은 상위 8위이다(KA&FTC 2021). 그 밖의 분화나 정원용은 전국적으로 분포하는 수국 축제의 규모와 숫자 그리고 수국을 정원수로 이용하는 가구가 늘어남 에 따라 거래량은 상당히 많을 것으로 예측된다.

수국은 동북아시아, 북아메리카 동부 및 남아메리카의 온대 및 열대 지역에 23종이 분포하는 것으로 알려져 있다(Kardos 2006). 보편적으로 재배되어지는 종으로는 Hydrangea macrophylla, H. serrata, H. arborescens, H. paniculata, H. aspera, H. quercifolia, H. anomala가 있다. 그 중 가장 인기가 높아 재배 및 유통이 많이 되어지고 있는 종으로는 H. macrophylla 와 H. serrata가 있고 절화와 분화시장에서 대부분 거래되어지 고 있다.

H. macrophylla와 H. serrata에 속하는 품종은 1,000개가 넘게 개발되어 있다(Owen et al. 2016). 두 종의 꽃눈은 직전 해에 형성되어 당해 꽃이 피고 H. serrata는 H. macrophylla 보다 저온에 강한 것으로 알려져 있지만 대부분 꽃눈이 다른 종과 비교해 저온에 약해 다음해에 꽃을 볼 수 없는 경우가 있어 식재 지역에 한계(USDA hardiness zone 6~9, -23. 3℃~1.1℃)가 있다(Reed 2000). 일반적으로 수국은 토양 pH 에 따른 알루미늄 흡수율의 차이로 화색에 변한다. 토양 pH 가 5.5이거나 더 낮을 경우에 알루미늄 흡수량이 더 많아 파 란색 꽃이 되고 7.0이거나 높을 경우에 알루미늄 흡수량이 낮 아져 분홍색 꽃을 볼 수 있게 된다(Wade 2009). 꽃은 두가지 종류의 장식꽃과(불임화) 비장식꽃(가임화)을 가지고 있다 (Waki et al. 2018). 장식꽃과 비장식꽃의 배열과 비장식 꽃의 수에 따라 화서 모양이 나뉜다(Uemachi and Okumura 2004). 수국의 화서 모양은 크게 두가지로 나눌 수 있는데 편평형과 원형이 있다.

현재도 그 인기를 유지하기위해 유전적 다양성이 높고 독특 한 특성의 품종개발이 필요하다. 초기 육종 목표에는 꽃 크기 증가와 꽃 색 다양화에 초점이 맞춰져 있었다(Lawson-Hall and Rothera 2005). 최근 정원용 수국의 인기가 증가함에 따 라 그에 맞는 육종이 진행되고 있고 특히 재개화성과 병충해 저항성, 저온 저항성, 가뭄 내성, 화서 형태 등이 고려사항이 되었다. 대부분의 수국은 꽃눈 분화의 특성으로 파종 후 2년 생부터 개화가 가능하고 충분한 저온요구도를 충족하였을 때 정상개화가 이루어진다. 정상 개화를 확인하고 선발된 실생을 번식하여 다양한 환경에 여러 해를 걸친 평가를 통해 안정성 을 확인하는 과정이 3~5년의 시간이 걸린다. 최종적으로, 최 초 교배부터 새 품종 개발까지 4~7년 이상의 시간이 걸린다 (Kardos 2006).

이처럼 교배 후 정상적인 꽃을 확인하고 재개화성 등의 여부 를 확인하여 선발하는 시간을 단축시키기 위한 유전 육종에 대 한 연구가 진행되고 있다. Wu and Alexander(2020)는 수국 꽃 특성 중에서 가장 중요한 재개화성과 화서 형태에 관여하는 유 전적 메커니즘을 marker-assisted selection(MAS)을 활용하여 입증하였다. 또, 수국은 불임화의 꽃받침 숫자에 따라 홑꽃 (3~4장)과 겹꽃(4장 이상)으로 분리하는데 겹꽃을 초기 선발 할 수 있도록 겹꽃과 관련된 유전자를 분석하고 그것을 기반 으로 SSR markers를 개발하였다(Waki et al. 2018). 분자적인 연구 이외에도, 수국의 교배 효율 증진을 위한 자가불화합성 (self-incompatibility)을 H. macrophylla, H. paniculata 그리고 H. quercifolia에서 확인하였고(Reed 2003;Reed 2005) 이것을 타파하기 위한 방법으로 화서에 온탕 처리하는 기법이 연구되 었다(Suyama et al. 2013). 하지만 수국에 자가불화합성이 없다는 측면도 있어 의견이 분분하다(Uemachi and Okumura 2012). 화서의 유전에 대한 연구로는 일본에서 2012년 H. serrata(편평형)한 개와 두가지의 원형 품종을 이용하여 교배 후 F₁의 형질을 확인한 결과 전체 편평형이 나옴을 확인 후 F₂ 의 자손의 화서의 모양을 확인하여 편평형과 원형이 3:1의 분 리비를 보여 단일 유전자에 의해 형질이 결정되는 것을 확인하 였다(Uemachi and Okumura 2012). 추가적으로 화서의 발달 모양을 편평형과 원형으로 구분하여 연구한 결과 장식화의 수 와 관련된 양적 변화가 아니라 화서의 발달에 차이를 보여 질 적 변화임을 발견하고, 이와 관련된 유전자를 찾기 위해 H. serrata의 편평형 화서의 돌연변이체를 발견하였고 정상 식물 과 돌연변이체 식물의 게놈 비교에 관한 후속연구 중이다. 이 와 같은 연구들은 수국 실생의 개화는 2년이 걸려 화서나 화형 을 통한 선발 시간을 크게 단축시키고 육종 효율을 증진시켜 다양한 육종 재료(Germplasm)개발에 기여하고 있다.

본 연구는 교배에 사용된 품종을 대상으로 SSR markers를 이용한 품종간 유연관계 파악과 더불어 종자 형성 및 발아를 확인하여 교배 화합성과 불화합성을 확인하기 위해 수행되었 다. 교배로 획득된 실생을 통해 이전에 보고된 적 없는 화서 유형과 잎 모양의 유전과 연관 분석을 하기 위해 수행되었다. 이것을 통해 교배 조합 작성 단계 또는 1년생 교배 실생 잎 모양을 통한 빠른 화서 유형 선발과 분리가 가능하여 육종기 간 단축을 기대할 수 있을 것이다.

재료 및 방법

식물재료

2018년 수집된 수국 품종을 이용하여 수국 종간(Hydrangea macrophylla × H. serrata) 및 수국 화서 유형 별 교배를 실시 하고 획득 자손의 형태학적 관찰을 위해 H. macrophylla × H. serrata, H. macrophylla × H. macrophylla (원형 × 원형, 원형 × 편평형, 편평형 × 편평형)의 조합으로 교배 조합 작성 후 5개 화서 30개 이상의 꽃을 대상으로 교배를 실시하였다. 2019년 ‘Red Ace’ × ‘Kurenie’ 외 9개 조합을 통해 획득된 종자 10,137개를 파종하였고 발아묘 4,592개를 9×9×9(cm) 사각 화 분에 실외 재배하였다. 재배 환경은 스마트측정제어기 DAONi (DAONI-con, danonrs, Korea)를 이용하여 모니터링하였다. 2020년에 1,807개체를 루트플러스(GS-AP300M, GS Korea, Korea)에 이식하여 관리번호 부여 후 2021년, 화서 유형 및 잎의 실측에 사용하였다. 비료 관리는 화분 당 3월에 멀티코 트 4(14-14-14, Haifa, Israeli) 75g 처리하고 9월에 멀티코트 6(14-14-14, Haifa, Israeli) 88g 처리하여 연 2회 처리하였다.

DNA 추출, Amplification 및 분석

교배에 사용된 품종간 유연관계 파악을 위해 다섯가지 품종 의 어린잎에서 gDNA를 추출하였다. DNA 추출은 HiGene^TM Genomic DNA Prep Kit(GD263-060, Solgent, Korea)를 이용 하여 매뉴얼에 따라 추출하였다. 추출된 gDNA는 1.6% agarose gel상에서 전기영동 후, UV 조명 아래서 형광 밝기를 상대 비교하여 농도를 확인하였다. 증폭은 SSR marker primer 68개를 이용하여(Table 1), Solog^TM e-Taq DNA Polymerase (SET15-R500, Solgent, Korea) 매뉴얼에 따라 총 total volume 20μL가 되도록 조성하여 시행하였다. 조제된 PCR Mixture는 95℃에 3분동안 최초 denaturation 이후, 95℃에 1분, 60℃에 1분으로 구성된 반응을 2번 반복한 다음 95℃에 30초, 60℃에 30초, 68℃에 30초로 구성된 반응을 27번 반복한 후 최종적으 로 68℃ 4분 extension 후 4℃에서 보관하였다. 완료된 샘플 은 1.6% agarose 젤에 75 Volt, 50분 전기영동을 진행한 후 밴 드를 확인하였다. 결과 분석은 BlueSky Statics(Open Source Desktop Edition. Ver 7.0, BlueSky, USA)를 사용하여 군집 분석을 시행하였다.

조사방법

2021년 5~6월 개화기에 1,807개체 전체 화서 유형 조사를 실시하였다. 화서 유형 조사는 개체당 1개 이상의 화서를 보 고 판단하였고 편평형과 원형 두가지 모양을 기준으로 조사하 였다(Fig. 1). 잎 데이터 수집은 화서 유형에 따라 10개 잎을 가장 상부에서 아래로 3번째 마디 잎을 채취하여 실측 조사하 였다. 이미지 분석과 측정은 Imagej software(ImageJ 1.52a, National Institutes of Health, USA)를 이용하였다.

결과 및 고찰

품종간 유연관계와 종자 형성

교배 화합성과 불화합성을 확인하기 위해 SSR markers를 이용한 교배에 사용된 총 9개 품종 중 5개 품종의 유연관계를 분석하였다. 분석 결과 Hydrangea macrophylla와 H. serrata 두개의 그룹으로 나뉘었다(Fig. 2). H. macrophylla와 H. serrata 는 두 그룹 간의 형태학적 및 지리학적 분포차이를 기반으로 종의 분리가 지지되어 왔다(Rinehart et al. 2006). 게다가 H. serrata와 H. macrophylla는 염색체 수가 같더라도 DNA 함량 이 H. macrophylla가 5.8%가 더 많다(Zonneveld 2004). 이러 한 연구들은 두 종의 분리에 근거가 되어 왔고 본 실험에서 도 두가지 그룹으로 나뉘었다. 하지만 H. serrata는 수국의 아종으로 기재되기도 하고 단일 종으로 기재되기도 하며 H. macrophylla와의 동정과 계급 설정에 혼란이 많은 것으로 알려져 있다(Kang and Chung 2019). Fig. 2에서 ‘Romance’ 는 H. serrata와 형태학적으로 유사한 형태였지만 ‘Ivory’와 ‘Verna’ 두 품종과 함께 H. macrophylla 그룹에 속하였다.

그럼에도 H. macrophylla ‘Romance’(♀)와 H. serrata ‘Aieheme’(♂)는 1258개의 종자를 형성했고 699개가 발아하였 다. 같은 그룹 내에 H. macrophylla ‘Romance’ (♀)와 H. macrophylla ‘Ivory’(♂)와 교배에서도 600개의 종자가 형성되 고 455개가 발아가 되었다(Table 2). 종이 다르지만 같은 종내 교배와 비교하여 종자 형성 및 실생 획득이 가능한 것으로 보 아 두 종의 혼합 교배는 종내 교배만큼 교배 화합성이 높아 더 큰 분류로 보았을 때 같은 그룹에 속할 것으로 사료된다. 이는 H. macrophylla와 H. serrata가 DNA 함량의 차이는 있 으나, 염색체는 2n=2x=36으로 동일하여 교배 화합성이 높았 을 것으로 예상된다(Zonneveld 2004).

수국은 자가불화합성(Self-incompatibility)이 있는 것으 로 알려져 왔다. H. macrophylla에서 수분 후 72시간 뒤 자가 수분과 타가 수분을 비교한 결과 배우체 자가불화합성 (Gametophytic self-incompatibility)이 발견 되었다고 보고 된 바 있고(Reed 2005), H. paniculata와 H. quercifolia에서도 배 우체 자가불화합성이 보고 되었다(Reed 2003). 이를 확인하기 위하여 교배를 통한 종자 형성과 종자의 발아율을 확인해 보 았다. 타가 수분을 통해서는 적게는 311개에서 많게는 3514개 의 종자가 형성된 반면 자가 수분으로는 0개에서 많게는 173 개의 종자가 형성되었다(Table 2). 자가 수분에서 원형 화서 를 가진 ‘Adria’와 ‘Alps’에서 100개 이상의 자가 수정 종자를 얻었으나 종자가 발아되지 않았다(Table 2). 다른 원형의 자 가 수분을 통한 종자 형성은 없거나 극소량이었는데 이러한 현 상이 위자가불화합성(Pseudo-self-incompatibility)으로 보고된 바 있고(Reed 2003), 본 연구의 결과도 같은 이유로 추측된다. 반면에 편평형 화서의 자손에서는 쉽게 자가 수정이 되는 것을 확인하였다(자료 미제시). 2020년 ‘Romance’ × ‘Kwokwon’의 편평형의 한 자손으로부터 자가 수분 종자를 697개 획득하여 파종 한 결과 314개가 발아하였다. 원형 화서의 식물은 자가 수분 종자를 얻지 못하거나 발아되지 않는 것을 확인한 반면 편평형 화서의 식물체들은 자가수분 종자를 얻는 것이 쉽고 잘되는 것으로 보아 수국의 화서에 관여하는 유전자가 자가불 화합성(SI)에 관여하는 유전자와 인접한 위치에 있을 것으로 예측된다.

모부본의 화서 형태에 따른 자손의 화서 유형 분리

위의 교배를 통해 획득된 자손을 통하여 화서의 유형 분리 를 조사하였다. 화서의 유형은 원형이 열성, 편평형이 우성인 단일유전자에 의한 우성-열성 방식으로 유전된다(Tränkner 2019). 실험 결과에서도 마찬가지로 원형이 열성, 편평형이 우 성임을 확인하였다(Table 3). 부모본의 화서 형태별 교배 결 과, 원형 화서 모본과 원형 화서 부본을 교배하였을 때 전체 자손이 원형 화서로 나타났다(Table 3). 원형 화서 모본과 편 평형 화서의 부본을 교배하였을 때(‘Red Ace’ × ‘Kurenie’) 자 손은 전체 편평형 화서가 나왔다. 편평형 화서 모본과 원형 화 서 부본을 이용한 교배에서는 전체 자손에서 편평형이 확인되 었다. 편평형 화서 모본과 편평형 화서 부본의 교배에서도 전 체 자손이 편평형 화서로 확인되었다. Table 3에서 ‘CH’ × ‘Verna’, ‘Romance’ × ‘Ivory’, ‘Romance’ × ‘Kwokwon’의 조합 에서 각 2개체씩 서로 다른 유형의 화서가 확인되었는데, 이 는 다른 교배 조합 식물의 혼입이 의심된다. 이를 통해 화서 의 유형이 단일 유전자에 의한 우성-열성 유전임을 확인하였 고, 본 실험의 결과 편평형 화서가 사용된 모든 교배 조합의 자손들은 전체 편평형이 나오는 것으로 보아 실험에 사용된 편평형 화서의 품종들이 모두 화서 유전자가 동형접합체로 사 료된다. 교배에 모부본 중 편평형 화서의 식물이 사용된다면 F₁은 전체 편평형이 획득되는 것은 교배 전략 수립 단계에서 목표 화서 유형에 참고할 수 있을 것으로 기대된다.

화서와 잎 모양의 관계

전체 자손의 원형 화서와 편평형 화서의 잎 모양은 각 화서 에 따라 원형 화서의 식물 잎은 잎의 끝이 짧고 엽폭과 엽장 이 비슷하여 더 원형에 가까우며, 편평형 화서의 식물 잎은 잎 의 끝이 길고 엽폭 보다 엽장이 더 길어 타원형에 가깝운 일 관된 특징이 확인되었다(Fig. 3). 같은 위치의 원형 화서의 잎 은 편평형 화서 잎과 비교해 엽폭과 엽장이 비슷한 둥근 형태 이며 광택감이 더 있고 잎의 가운데 엽맥에 따라 말림 현상도 적었다. 엽의 크기 또한 편평형 화서 잎보다 원형 화서 잎이 크다는 것을 확인하였다. 잎의 가로와 세로의 비율이 편평형 은 1:2.37, 원형은 1:1.47로, 원형 화서의 잎이 엽장이 엽 폭의 1.47로 원형에 가깝고 편평형 화서는 엽폭에 비해 엽장이 2배 이상 긴 2.37로 길쭉한 타원형에 가까운 형태였다(Table 4). 또, 잎 끝부분의 길이가 편평형 화서의 잎은 2.25, 원형 화서 의 잎은 1.47cm로 잎의 길이와 대비해 편평형 화서의 잎의 끝 부분이 훨씬 길고 뾰족하였다. 추가적으로 잎의 넓이와 잎의 끝부분부터 아래로 2/3지점의 넓이를 측정하여 비를 보았다. 편평형 화서 잎은 1:0.64, 원형 화서 잎은 1:0.75로 대체적으 로, 편평형 화서의 잎이 원형 화서의 잎과 비교했을 때 가파르 게 좁아지는 형태였다.

전체 자손의 잎이 화서의 형태에 따라 두가지 형태로 분류 가 되었는데, 그 중 원형 화서의 모본과 편평형 화서의 부본을 교배하여(‘Red Ace’ × ‘Kurenie’) 나온 자손에서는 조금 다른 형태를 확인하였다(Fig. 3, Table 4). 전체 자손의 화서의 형태 는 편평형이었으며, 전체적인 잎의 크기는 원형 화서의 잎의 크기와 비슷하였고 가로와 세로의 비율은 1:1.74로 편평형 화 서의 잎과 원형 화서의 잎의 가로와 세로의 비율의 중간 값이 나왔다. 잎의 끝 부분 길이 또한 2.02cm로 중간 값이 나왔고 잎 넓이 변화 비율도 1:0.69로 원형 화서 잎과 편평형 화서 잎 의 중간정도로 잎이 좁아지는 것이 확인되었다.

화서 모양이 원형인 식물 잎모양은 전체적으로 원형에 가까 운 형태이고, 편평형인 식물의 잎모양은 타원형에 가까우나, 원형과 편평형의 혼합 교배를 통해 나온 식물의 잎은 중간형 이 나왔다. 결론적으로 잎의 모양은 화서의 모양과 연관 되어 있고 중간유전의 형태라고 생각된다.

본 연구에서는 SSR 분석과 종자 형성 및 발아를 통한 교배 화합성과 획득된 실생을 이용한 화서 유형과 잎모양의 유전 양상을 파악했다. 교배에 사용된 품종은 H. macrophylla와 H. serrata로 총 두개의 그룹으로 나뉘었고 두 그룹 간의 교배 (종간교배)는 종내 교배와 비교하였을 때 종자 형성과 실생 획득이 잘 되는 것을 확인함에 따라 두 종의 교배 친화성은 높은 것으로 보인다. 또, 타가 수분과 자가 수분을 통한 종자 형성과 발아를 통해 자가 불화합성을 확인하였다. 화서는 우 성-열성 방식으로 유전되며, 원형 화서 식물끼리의 교배에서 원형 화서의 F₁을 얻을 수 있었고 교배 모부본 중 어느 한쪽이 라도 편평형 화서가 들어가게 된다면 전체 편평형 화서의 자 손을 얻었다. 그 결과로 편평형 화서의 식물 육종에는 원형 화 서 식물을 이용해도 되나, 원형 화서 식물 육종에는 원형 화서 만 교배에 사용할 것을 권장한다. 또, 교배 후 실생묘는 2년차 부터 개화가 가능하여 1년생의 화서 분리 및 선발을 할 수 없 으나 발아 후 1년생 식물의 잎의 모양이 원형에 가까운 것은 원형 화서로 분류가 될 수 있고, 잎 끝이 길고 길쭉한 타원형이 라면 편평형 화서로 분류할 수 있을 것이다(Table 4, Fig. 3). 추가적으로, 2020년 9개의 교배조합 중 ‘Romance’ x ‘Kwokwon’ (편평형x원형) 조합의 편평형의 화서를 가진 한 자손으로부터 자가 수정 종자 697개를 얻어 파종한 결과 잎의 모양이 엽장 과 엽폭이 비슷한 둥근 잎과 엽장이 엽폭보다 큰 타원형 잎의 자손을 얻었다(자료 미제시). 1년생 식물로 화서의 모양은 확 인할 수 없었으나, 본 연구의 결과로 보아 편평형 화서의 자손 과 원형 화서의 자손을 2022년에 확인할 수 있을 것으로 예상 된다. 이것으로 원형과 편평형의 우성-열성 유전 법칙을 확인 하고 본 연구 결과인 잎 모양과 화서 형태와의 연관성을 더욱 입증할 수 있을 것으로 예상된다.

이에 따라 수국 화서 확인을 위한 분자 육종법 이외의 방법으 로써 본 연구결과가 사용될 것으로 기대되며, 수국 육종 전략 수립과 수국 육종 선발 과정을 쉽고 빠르게 하여 육종에 소요되 는 시간, 노동력 및 비용 절감에 도움이 될 것으로 기대한다.