서 언
최근 우리나라는 이상기후로 인한 강설량이 증가하고 있으 며 노면의 제설 및 결빙방지를 위한 제설제의 사용이 크게 증 가하고 있다(Park 2001). 일반적으로 사용되는 염화물계 제설 제에는 염화칼슘(CaCl2)과 염화나트륨(NaCl)이 있는데, 염화 칼슘은 염화나트륨보다 발열량이 높고 단기간에 눈을 녹이는 장점이 있어 국내에서는 염화칼슘 제설제의 사용량이 지속적 으로 증가하고 있다(Kim and Lee 2014). 염화칼슘의 사용량 은 2007년부터 2010년까지 약 50,000톤에서 90,000톤으로 증 가하는 등 사용량이 지속적으로 증가하였다(Sin et al. 2010). 그런데 염화칼슘(CaCl2)으로 인한 식물의 염해가 우려되고 있 으며(Sung et al. 2010), 제설제는 식물의 생장을 저해하고 조 기 낙엽 및 고사 등의 피해를 유발할 가능성이 크다고 하였다 (Kwon et al. 2014). 순비기나무(Vitex rotundifo)와 작살나무 (Callicarpa japonica)는 염화칼슘 1.0% 이하의 농도까지는 생 육이 가능하였으나, 염화칼슘의 농도가 증가할수록 초장, 엽 장, 엽수 모두 감소하여 염화칼슘 3.0%처리에서는 식물이 고 사하였다(Lee et al., 2013). 사철나무(Euonymus japonica)의 경우에는 염화칼슘 3.0% 농도에서도 생존하여 다른 종보다 내 염성이 강한 식물이라고 평가되었다. 도심 내 조경수로 사용 되는 영산홍(Rhododendron indicum)과 회양목(Buxus koreana) 의 경우 염화칼슘 0.5% 이상의 농도에서 생육저하가 일어나 는 등(Ju et al., 2016), 식물의 종류에 따라 내염성이 다르게 나타났다.
내염성을 평가하는데 있어 식물의 생장 뿐 아니라 항산 화 물질의 활성을 통해서도 알아볼 수 있다. 그 중 MDA (Malondialdehyde), Proline, SOD(Superoxide Dismutase) 분 석이 많이 이용되고 있다. 환경 스트레스는 세포에서 지질 과산 화를 증가시키는데(Liu et al. 2008), MDA 함량은 활성산소가 세포막의 불포화지방산에 과산화를 일으켜 발생하는 산화 정 도를 나타내는 지표로 사용된다(Scandalios 1993). Proline은 식물이 염 스트레스를 받았을 때 생성되며 삼투압 안정을 통 한 내염성을 높인다고 알려져 있다(Hasegawa et al. 2000;Stewart and Lee 1974). SOD는 산화 스트레스에 대해 항산화 기작으로 작용하는 효소이며, H2O2 제거에 중요한 역할을 한 다고 알려져 있다(Daza et al. 1993).
가침박달속(Exochorda) 식물은 낙엽 활엽관목으로 한국, 일본, 중국과 같은 아시아에만 분포하는 특산속 식물로 보고 되어 있다(Gu et al. 2003). 한반도에는 가침박달(Exochorda serratifolia S.Moore) 1종만이 보고되었으며 전라남도 우이도, 충청북도 단양, 인천광역시 덕적도에 분포하고 있다(Lee and Yim 2002). 가침박달의 꽃은 4~5월 중순에 개화하며 흰색의 꽃이 총상꽃차례로 3~6송이씩 가지 끝에 달려 관상적 가치가 높으며 내한성, 내음성, 내병충성 등 환경적 스트레스에 대한 내성이 강하다고 알려져 있어 원예적으로 활용 가능성이 높은 자생수종으로 알려져 있다(Lee et al. 1987). 하지만, 특산속 식물로 보고된 가침박달의 경우 내염성에 관한 연구에 대해서 는 아직 미흡한 실정이다.
이에 본 연구는 국내 원예용 낙엽활엽관목으로 가치가 높은 자생수종인 가침박달을 대상으로 염화칼슘(CaCl2)의 농도별 처리에 따른 생육 및 생리적 반응을 평가하여 식물의 내염성 을 구명하는데 목적이 있다. 이는 향후 가침박달을 정원에 식 재하였을 때 최적의 생육을 나타낼 수 있는 장소를 선정하는 데 유용한 정보로 제공될 수 있을 것이다.
재료 및 방법
식물 재료 및 염화칼슘 처리
경기도 용인시에 위치한 한택식물원에서 가침박달 2년생 묘목을 2020년 5월 12일에 분양 받아 실험 온실에서 1개월간 순화시킨 후 사용하였다. 가침박달의 초기 생장 상태는 초장 8.7±2.7cm(mean±SD), 초폭 12.2±1.8cm, 엽수 7±1.2개, 엽 장 5.8±0.9cm였으며, 직경 12cm 플라스틱 포트에 정식하였 다. 정식 용토는 원예용상토(High, Bunong Co., Ltd., Korea) 를 사용하였고, 정식 후 8주 동안 매주 염화칼슘을 1회 200mL 씩 토양 관주 처리하였으며, 처리 이외에 발생 가능한 식물의 건조를 방지하기 위해 수분 관리는 주 1회 추가적으로 200mL 씩 관수하였다. 염화칼슘의 농도는 0, 1.0, 3.0, 5.0%로 하였 다. 염화칼슘의 농도 설정 기준은 목본류의 내염성 평가와 관 련된 선행연구에서 염화칼슘의 농도를 1.0~3.0%로 하고 있었 으며(Ju et al. 2016;Kwon et al. 2014), 식물종에 따라서는 염화칼슘 3.0%에서도 생존을 하는 경우도 있어 염화칼슘 5.0%를 실험 처리로 추가하였다. 처리당 5본 3반복 난괴법으 로 배치하였으며 배재대학교내 유리온실에서 실험을 진행하 였다. 실험 기간은 2020년 7월 15일부터 2020년 9월 16일까지 8주간 진행하였으며 온실내 온도와 습도는 HOBO MX2301A (ONSET, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 실험 기간 동 안 온실내 평균 기온은 25.41±2.75°C(mean±SD), 최고기온 29.2±3.44°C, 최저기온 22.54±2.54°C, 상대습도 81.84±9.06% 였다.
생장특성 조사
염화칼슘 처리 후 4주 간격(0, 4, 8주)으로 가침박달의 생육 변화를 조사하였다. 조사항목으로는 초장, 초폭, 엽장, 엽수, 생체중, 건물중을 조사하였으며, 초장은 지제부에서 정단부까 지의 길이를 측정하였고 엽장, 엽수는 정단부를 기준으로 4번 째 전개된 잎을 조사하였다. 건물중은 95°C의 열풍건조기 (HB-502M, HANBAEK Co., Korea)에서 식물체가 완전 건조 상태가 되도록 48시간 이상 건조시킨 후 무게를 측정하였다.
엽록소 함량 측정
엽록소 함량 측정은 Yoshida et al.(1971)의 방법에 따라 8 주차 가침박달의 염화칼슘 농도 처리에 따라 진행하였다. 생 체중 2g을 마쇄한 후 플라스틱 튜브에 넣고 80% Acetone에 침지한 후 4°C 냉장고에서 48시간 추출하여 사용하였으며 추 출액은 분광광도계(X-ma 1200, Human Co., China)를 이용하 여 663nm와 645nm에서 흡광도를 측정하였다.
항산화 효소 측정
내염성과 관련된 항산화 반응을 알아보고자 8주차 가침박달 의 농도별 MDA, Proline, SOD를 분석하였다. MDA함량은 Du and Bramlage(1992)의 방법을 이용하였다. 생체 시료 0.5g에 액화질소를 첨가하여 마쇄하였으며, 4°C의 70% cold ethanol을 첨가하여 균질화하였다. 이후 4°C, 25,000×g에서 15분간 원심 분리기(VS-15CF, VISION Scientific Co., Ltd., Korea)를 이용하 여 원심분리하였다. 시료의 상등액 2mL 20% trichloroacetic acid(TCA) 2mL, 20% TCA에 용해된 0.67% thiobarbituric acid(TBA) 1mL과 100mM butylated hydroxytoluene 50μL을 첨 가하여 항온수조(WB-11, DAIHAN Scientific Co., Ltd., Korea) 를 이용하여 95°C에서 15분간 진탕한 후 냉각하였다. 과산화지 질이 포함된 용액을 15,000×g에서 15분 원심분리한 후 상등액의 흡광도를 분광광도계를 이용하여 450nm, 532nm, 600nm에서 측정하였다.
Proline 함량은 생체중 0.5g의 잎을 액체질소를 첨가하여 동결 마쇄하고 3% sulfosalicylic acid 10mL를 첨가하여 균질 화 시킨 후 4℃, 4,000×g 10분간 원심분리하였다. 1mL의 상등 액, 1mL의 acid-ninhydrin과 1mL의 acetic acid를 넣어 혼합하 고 항온수조를 이용하여 95℃에서 60분간 진탕한 후 냉각하였 다. Acid-ninhydrin은 acetic acid 60mL와 6M phosphoric acid 40mL를 혼합한 후 2.5g의 ninhydrin을 넣고 교반하여 조 제하였다. 반응이 종료된 용액에 3mL의 toluene을 넣고 30초 간 교반하고 상온에서 10분간 정지시켜 반응 용액의 발색을 분리하였다. Proline 정량은 toluene을 Blank로 사용하여 520nm 에서 각 반응 시료의 흡광도를 측정하고 Bates et al.(1973)의 방법을 이용하였다.
SOD 활성은 생체중 0.2g과 extraction buffer(pH 7.8, 50mM phosphate, 0.1% BSA, 0.1% ascorbate, 0.05% mercaptoethanol (W/V)) 2mL을 첨가하여 막자 사발을 이용하여 곱게 갈아 얻 은 추출액을 4°C, 15,000×g 10분간 원심분리하였다. 분리된 상등액을 완충용액(50mM phosphate, pH 7.0, 0.2mM EDTA) 으로 이용하여 효소활성 측정용액으로 사용하였다. SOD의 효 소활성이 Nitroblue tetrazolium(NBT)의 환원을 저해하는 능 력을 측정하는 photochemical NBT method를 사용하였다 (Beyer Jr and Fridovich. 1987). 추출한 조효소 60μL와 3.0mL assay-buffer(pH 7.8, 50mM phosphate, 9.9mM L-methionine, 57μM NBT, 0.0044% Riboflavin)를 혼합하여 처리구별 식물체 생장상에 균일하게 조사하였으며, 흡광도 560nm에서 측정하 였다.
통계처리
각각의 측정된 데이터는 SPSS 프로그램(SPSS 23.0, IBM Corporation, USA)을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 하였 다. 각 식물의 염화칼슘 농도에 따른 생장 반응에서 통계적 인 차이가 유의한 경우에는 Tukey’s HSD(honestly significant difference) test(p=0.05)로 사후 검정을 하였다.
결과 및 고찰
염화칼슘 농도 처리에 따른 가침박달의 생장 변화
염화칼슘 농도에 따른 가침박달의 초장은 0, 1.0, 3.0, 5.0% 농도별로 각각 10.5, 13.8, 13.3, 3.0cm로 0, 1.0, 3.0% 처리간 에는 통계적인 유의성이 나타나지 않았고 염화칼슘 5.0% 처 리에서 유의하게 초장이 짧게 측정됐다(Table 1). 염화칼슘 5.0% 처리구는 0% 대조구에 비해 약 71.4% 초장이 짧았다. 초폭은 염화칼슘 0, 1.0, 3.0, 5.0% 농도별로 각각 12.4, 13.4, 10.8, 3.0cm였으며, 엽장은 각각 5.8, 6.6, 4.9, 1.7cm로 염화 칼슘 1.0% 처리구에서 가장 길었으며, 염화칼슘 5.0% 농도를 제외한 처리구에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 염화 칼슘 5.0% 처리구는 0% 대조구에 비해 초폭, 엽장이 각각 75.8, 70.7% 정도 짧았다. 지상부 생체중의 경우 Table 2와 같이 염화칼슘 0, 1.0, 3.0, 5.0% 처리구에서 각각 3.1, 4.1, 2.9, 0.5g로 염화칼슘 1.0%에서 가장 높았으나 0, 1.0, 3.0% 처리간 통계적인 유의성은 없었으며, 지하부 생체중은 처리구 에서 각각 2.1, 3.2, 2.8, 1.0g으로 1.0%에서 가장 유의성이 높 았다. 염화칼슘 5.0%처리는 다른 처리에 비해 생체중이 유의 하게 낮았는데 지상부 생체중의 경우 염화칼슘 0% 대조구에 비해 83.9%가량 감소되었으며, 지하부 생체중은 52.4%가량 감소하였다. 결과적으로 총 생체중의 유의성은 염화칼슘 0, 1.0, 3.0, 5.0% 처리구에서 각각 5.2, 7.3, 5.7, 1.5g으로 1.0% 와 3.0%에서 가장 유의성이 높게 나타났다. 지상부 건물중의 경우 처리구에서 각각 0.9, 1.5, 1.2, 0.2g으로 1.0%와 3.0%에 서 가장 높게 나타났으며, 지하부 건물중은 각각 0.5, 0.8, 0.7, 0.3g으로 1.0%에서 유의성이 높게 나타났다. 총 건물중 은 염화칼슘 0, 1.0, 3.0, 5.0% 처리구에서 각각 1.4, 2.3, 1.9, 0.5g으로 염화칼슘 5.0% 농도에서 가장 낮았다. 흥미로운 것 은 염화칼슘 0, 1.0, 3.0%의 처리구에서 가침박달의 생체중이 나 건물중의 결과를 미루어 볼 때 염화칼슘 1.0% 또는 3.0% 처리에서도 생육 저하가 나타나지 않았다는 것이다. 염화칼슘 을 사용한 다른 선행 연구결과를 비교해 보았을 때 사철나무, 영산홍, 회양목 등은 염화칼슘 3.0%에서 생육 저해 증상이 나 타나 전부 고사하였다(Ju et al. 2016). 가침박달은 염화칼슘 3.0% 농도처리까지 생장이 저하되지 않았는데 실험 환경이 달라 직접적인 비교는 어렵지만 가침박달이 목본 식물 중에서 도 내염성이 강할 수 있음을 알 수 있었다.
엽록소 함량 측정
엽록소 함량은 대조구에서 27.5mg･g-1로 나타났으며 염화 칼슘 1.0, 3.0, 5.0% 처리구에서 각각 12.9, 14.0, 15.7mg･g-1 으로 유의적으로 감소하였다(Fig. 1). 일반적으로 식물의 엽록 소 함량 변화는 건조 스트레스나 염으로 인한 피해 등 외부 환경적 스트레스로 인해 감소한다고 알려졌지만(Agastian et al. 2000;Gadallah 1999;Hernandez et al. 1995;Kim et al. 2018), 일부 식물 종은 오히려 엽록소 함량이 증가하는 경우 도 보고되고 있다(Ormrod et al. 1999). 가침박달의 엽록소 함 량은 염화칼슘 농도 1.0% 이상의 처리에서 감소하고 염스트 레스를 받았다고 할 수 있다. 하지만 가침박달의 초장, 초폭, 엽장, 엽수, 생체중, 건물중을 살펴보았을 때 유의성은 없었지 만 염화칼슘 1.0%가 오히려 대조구보다 수치가 높았고, 염화 칼슘 3.0% 처리와 대조구의 차이가 없는 것으로 보아 가침박 달은 염스트레스에 내성이 강하다는 것으로 판단된다. 가침박 달의 자생지가 해안가 주변에도 분포하는데(Kim and Lee 2014), 가침박달이 염스트레스에 강한 이유라고 판단된다. 하 지만 염화칼슘 5.0% 이상의 염 성분으로 농도가 높은 지역에 이식될 경우 염에 대한 피해를 받을 수 있기 때문에 염화칼슘 3.0% 이하의 농도를 고려하여 식재한다면 생장에는 무리가 없으며, 염 농도가 높은 겨울철 도심 속 가로변 등에서의 활용 가치가 높을 것으로 판단된다.
염화칼슘 농도 처리에 따른 가침박달의 항산화 효소 활성
염화칼슘 농도에 따른 피해수준을 파악하기 위해서 가침박 달 잎의 MDA함량을 분석한 결과는 Fig. 2A와 같다. MDA함 량은 대조구 23.9μmol･g-1에 비해 염화칼슘 1.0, 3.0, 5.0% 농 도처리구에서 각각 27.18, 27.88, 26.98μmol･g-1으로 MDA 함 량은 염화칼슘의 처리에 의해 유의하게 높게 측정됐다. 멀꿀 (Stauntonia hexaphylla)과 다정큼나무(Raphiolepis indica)의 내염성 평가 연구에서도 염화나트륨의 처리 농도가 높아 질수 록 MDA의 함량이 유의적으로 증가하였는데(Choi et al. 2013), 가침박달도 염화칼슘 1.0% 이상의 처리에서 염스트레 스를 받은 것임을 알 수 있었다.
염화칼슘 농도에 따른 가침박달의 Proline 함량은 대조구에 서 55.9μg･g-1이었는데, 염화칼슘 1.0, 3.0% 농도에서는 각각 94.5, 111.7μg･g-1으로 대조구보다 약 2.0배 높게 나타났다(Fig. 2B). 염화칼슘 5.0%처리에서는 Proline 함량이 225.5μg･g-1으 로 유의적으로 가장 높게 나타났다. 염화나트륨의 농도를 증 가시켰을 때 담배(Nicotiana tabacum) 잎에서도 Proline 함량 이 대조구보다 약 4.0배 이상 증가하였다(Lee et al. 1998). 가 침박달의 Proline 함량 증가는 염화칼슘으로 인한 탈수, 염분 스트레스 등의 피해로부터 식물을 보호와 관련된 것으로 보인 다(Cho 1999).
가침박달의 SOD 활성변화는 염화칼슘 농도 모든 처리구에 서 각각 15.5, 12.8, 20.7, 29.0U･g-1으로 염화칼슘 처리 농도 가 높아질수록 SOD 활성량이 증가되는 경향을 나타냈다(Fig. 2C). 이는 염 스트레스로 인해 발생하는 활성산소를 제거하기 위해 SOD의 활성량이 농도에 따라 증가되었다고 판단되며, 유채(Brassica napus) 유아 SOD 활성 연구에서도 염화나트륨 (NaCl) 처리농도가 0, 50, 100mmol으로 증가할수록 뿌리 재 생 억제에서의 평균 SOD 활성량이 처리구 각각 11, 13.67, 35.1%로 로 증가하는 양상이 확인되었다(Jalali-e-Emam et al. 2011).
종합적으로 가침박달에 염화칼슘을 처리했을 경우 염화칼 슘 1.0% 이상의 처리구부터 MDA가 증가하는 것으로 보아 모 든 염화칼슘 처리구에서 염스트레스를 받았다고 판단되지만 Proline과 SOD의 활성이 증가하는 등 염스트레스에 대한 항 산화 기전이 있었다. 가침박달은 염화칼슘 5.0% 처리구를 제 외하고 모든 처리구에서 초장, 초폭, 엽장, 엽수, 생체중, 건물 중 등 생육지표에서 통계적 유의성이 나타나지 않은 것으로 보아 염화칼슘 3.0%까지는 염에 대한 내성이 있는 것으로 판 단된다. 본 실험이 2개월의 짧은 기간에 걸쳐 실험이 진행된 바 장기간동안 염스트레스에 노출되었을 때 가침박달의 내염 성은 다르게 평가될 수 있는 한계가 있지만 가침박달이 염스 트레스에 대해 충분히 내성이 있으며 염 피해지역에 활용될 가능성이 있다고 판단된다.
