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끈끈이주걱은 끈끈이귀개과(Droseraceae)의 끈끈이귀개속 (Drosera)에 속하는 다년생 식충식물로 약 200여종의 끈끈이귀 개속 식물들이 전세계적으로 널리 분포한다(McPherson 2010). 그 중 북반구에 자생하고 있는 끈끈이주걱(Drosera rotundifolia L.)은 우리나라의 경상북도 이북 지역에서 자생하는데 대부분이 로제트 형태로 햇볕이 잘 드는 산지의 산성 토양 습지에서 자란 다. 우리나라에서 자생하는 끈끈이귀개속 식물에는 끈끈이주걱 (D. rotundifolia), 긴잎끈끈이주걱(D. anglica) 그리고 끈끈이귀 개(D. peltata) 등이 있다(Lee 2005).

오늘날 애완식물로서의 식충식물에 대한 관심이 높아지면 서 끈끈이귀개속 식물들은 무분별한 채취와 자생지 훼손에 따 른 위협에 직면하고 있으며, 특히 끈끈이귀개는 환경부 국립 생물자원관에서 발행하는 한국의 멸종위기 야생 동･식물 적색 자료집에 ‘관심대상’으로 지정되어 있다(Ahn 2012). 외국에서 는 끈끈이주걱의 식물추출물을 호흡기질환에 대한 항균성, 항 진균성 그리고 항종양 효과가 있어 인플루엔자, 백일해, 편도 염 그리고 천식 등의 치료에 이용되고 있다(Jadczak et al. 2017). 위와 같은 이유로 끈끈이귀개속 식물들의 군락지는 지 난 수십 년 간 자연서식지 감소의 결과로 인해 점차 줄어들고 있어 서식지 보전이나 제약용으로의 식물재료 수집에 어려움 을 겪고 있다(Krenn and Karting 2005). 그럼에도 불구하고 유전자원의 보전(Kim et al. 2006;Lee 2005), 식충식물로서의 관상가치 그리고 약용식물로서의 활용 가치(Jayaram and Prasad 2007)가 높아지고 있어 효율적인 대량번식 방법 개발 에 대한 필요성이 높아지고 있다.

끈끈이주걱의 번식은 가을에 포기나누기를 하거나 종자 파 종으로 가능하다. Cho and Lee(2016)는 자생끈끈이주걱에 있 어서 종자의 휴면 타파 및 발아조건 구명을 통하여 종자의 발 아를 촉진시키는 대량번식법에 관하여 보고하였고 최적 발아 조건에서의 발아율은 54.7%로 나타났다. 그러나 종자번식 방 법은 시간 소모가 크고 종에 따라 발아하는데 몇 달씩 걸리기 때문에 종자번식 이외의 대안으로 절편 조직으로부터 직접 식 물체의 재분화가 가능한 조직배양기법이 활용되고 있다. 지금 까지 끈끈이주걱의 조직배양을 통한 연구로 배지의 무기염류, pH, sucrose 농도 등에 따른 식물체 재생 효과(Lee 2005), 생 장조절물질의 종류 및 농도에 따른 효과(Bobák et al. 1995;Kim et al. 2006;Lee 2005) 그리고 잎과 정단부위 등의 절편 체 종류(Kawiak et al. 2003)에 따른 효과 등이 보고되었으나 번식 효율면에서 대량번식 체계에 이르기 까지는 많은 연구가 필요한 실정이다.

일반적으로 식물체 조직으로부터 식물체를 재생시키기 위 해서 캘러스 유도가 필수적이나 끈끈이주걱의 경우 캘러스 단 계를 거치지 않고 바로 절편 조직으로부터 식물체 재분화가 가능하다. 이 경우 잎 절편체의 표피세포로부터 눈이 분화되 어 신초가 형성된다고 하였다(Bobák et al. 1995). 식물의 조 직으로부터 바로 식물체가 재생되는 것은 아주 드문 현상이고 극히 일부 식물에서만 식물체가 재생된다(Konar and Nataraja 1965;Stolarz et al. 1991).

배양방법으로 대부분 고체배지를 많이 이용하나 대량으로 증 식하기 위해서는 액체배지의 이용이 효율적이다. 액체배지를 이용하면 고체배지보다 배지의 양분을 충분히 이용하여 생육이 휠씬 촉진되는 연구 결과들이 보고되고 있다(Wawrosch et al. 2009). 효율적인 대량번식을 위해 잎을 이용한 적절한 배양 방법 을 찾는 것이 대량증식체계 확립을 위해 선행되어야 한다.

본 연구는 끈끈이주걱의 잎 부위별 절편체를 이용하여 신초 증식 및 재분화에 적합한 무기염류 농도 및 배양방법, 광조건, cytokinin의 종류 및 농도 등의 효과를 구명하여 효율적인 기 내 대량번식 체계를 확립하고자 수행하였다.

재료 및 방법

건국대학교 글로벌캠퍼스에서 분양 받은 끈끈이주걱(Drosera rotundifolia) 배양묘를 본 연구의 실험재료로 이용하였다. 1/2MS 배지를 기본으로 하여 3% sucrose를 넣고 pH 5.6으로 조절한 후 0.8% agar를 첨가한 배지에서 배양묘를 계대배양하 면서 증식하였다. 배양묘의 잎 크기(엽신과 엽병의 길이와 폭) 가 2.0x0.6cm정도 되고 선모가 완전히 자란 배양묘의 엽 절 편을 공시재료로 사용하였다. 배양 온도는 23±1℃ 그리고 40 μmol･m^-2･s^-1의 광으로 16시간 조명(16/8h)하였다.

식물체 재생에 효과적인 엽절편의 형태를 알아보기 위해 엽폭 이 5±1mm(선모길이 미포함)의 엽신 부위, 사각모양의 4.5x 4.5±0.5mm 크기의 엽신, 7±1mm 길이의 엽병 그리고 크기가 13±1mm인 엽신과 엽병이 붙은 절편을 이용하였다(Fig. 1). 위와 같은 절편을 MS(Murashige and Skoog 1962) 배지를 기본으로 하여 무기염류의 농도를 달리한 1/4MS, 1/2MS, 1MS 그리고 2MS 에 3% sucrose를 넣고 pH 5.6으로 조정한 후 0.8% agar를 첨가한 배지에서 치상하였다. 배지는 petri-dish(100x15mm)에 25mL씩 분주하였고 절편체는 petri-dish당 12개씩 수평으로 치상하였으 며 각 처리당 3반복으로 하였다. 8주간 배양한 후 식물체 생존율, 식물체 재생률, 신초수, 신초장 그리고 뿌리발생률 등을 조사하 였다.

한편 액체배지의 효과를 알아보기 위하여 엽절편의 조제는 3가지 형태 즉, 사각형으로 자른 엽신, 엽신+엽병, 엽신+엽병(중 앙에 해부용 칼로 흠집을 냄)으로 하였다. 액체배지로 1/4MS, 1/2MS, 1MS에 3% sucrose를 넣고 pH 5.6으로 조절한 후 실 험하였다. 배지는 100mL 삼각플라스크에 50mL씩 분주하여 사 용하였다. 플라스크당 절편체를 20개씩 치상 후 160rpm 속도 로 진탕배양하였다. 각 처리마다 3반복으로 하여 배양 5주 후 식물체 생존율, 식물체 재생률, 신초수, 신초장 그리고 뿌리발 생률 등을 조사였다.

배양 중에 광의 효과를 알아보기 위하여 1) 암상태 하에서 4주 후 명상태 하의 1주, 2) 암에서 2주 처리 후 명상태 하의 3주 그리고 3) 명상태 하의 5주 등 3가지로 처리를 하였다. 엽 절편체는 사각형으로 자른 엽신을 이용하였고 액체배지의 농 도는 3% sucrose 를 첨가한 1/4MS, 1/2MS 그리고 1MS를 이 용하였다. 100mL 플라스크 당 절편체를 20개씩 치상한 다음 3반복으로 하여 160rpm에서 진탕배양하였다. 배양 5주후 식 물체 생존율, 식물체 재생률, 신초수, 신초장, 생체중, 뿌리발 생률 등을 조사였다.

식물체 재생에 미치는 cytokinin의 영향을 알아보기 위 해 3% sucrose가 첨가된 1/4MS의 액체배지를 기본으로 하여 BA(6-benzylaminopurine)와 kinetin 각각의 0.01, 0.1, 0.5, 1.0mg·L^-1에 NAA 0.01mg·L^-1를 혼용하여 실험을 수행하였 다. 사각형으로 자른 엽신을 절편으로 이용하였고 배지는 100mL 삼각플라스크에 50mL씩 분주하였으며 삼각플라스크 당 절편체를 20개씩 치상한 다음 160rpm에서 진탕배양하였 다. 암상태에서 2주간 배양한 다음 광상태로 옮겨 3주간 배양 한 후 식물체 생존율, 식물체 재생률, 신초수, 신초장 그리고 뿌리발생률 등을 조사였다.

실험의 결과들은 통계분석용 프로그램 SAS package(statistical analysis system, version 9.1, SAS Institute Inc.)를 이용하여 ANOVA 검정과 Duncan의 다중검정 p=0.05수준에서 분석하 였다.

결과 및 고찰

고체배지에서의 식물체 재분화

끈끈이주걱에 있어서 MS고체배지를 기본으로 하여 무기염 류의 농도 및 잎의 부위에 따른 절편의 형태를 달리하여 실험 을 수행하였다(Table 1). 식물체 생존율은 1/2MS 배지의 엽신 + 엽병의 절편에서 100%로 가장 높게 나타났다. 대체적으로 절편의 형태에 따른 1/4MS, 1/2MS, 1MS배지 처리에의 생존율 은 비슷한 경향을 보였으나 엽병만을 이용한 절편은 낮은 생 존율을 보였다. 고농도의 무기염류를 함유한 2MS배지에서는 대부분의 절편체들이 갈변하면서 고사하였다. 식물체 재생율 의 경우 1/4MS배지에서 사각형으로 자른 엽신 및 엽병, 엽신+ 엽병 절편에서 100%로 높게 나타났고 1/2MS배지에서도 사각 형으로 자른 엽신과 엽신+엽병에서 100%로 높게 나타났다. 2MS배지를 제외한 모든 배지에서 80% 이상의 높은 재생율을 보였다. 절편당 신초수는 1/4MS배지의 사각형으로 자른 엽신 과 엽신+엽병 그리고 1/2MS배지의 사각형으로 자른 엽신에서 1.8개로 가장 높게 나타났고 신초장은 1/4MS, 1/2MS의 사각 형으로 자른 엽신에서 0.8cm로 가장 높게 나타났으나 1/2MS 배지에서는 절편체 부위간에 유의성은 없는 것으로 나타났다. 무기염류의 농도가 높을수록 신초장이 감소하는 경향을 보였 다. 1/4MS와 1/2MS고체배지에서의 신초장은 절편 부위별로 크게 차이를 보이지 않았으나 사각형으로 자른 엽신과 엽신+ 엽병에서 식물체 재분화 및 신초생장이 양호한 것으로 나타났 다. 뿌리발생률은 1/4MS, 1/2MS배지의 사각형으로 자른 엽신 과 엽신+엽병에서 70% 이상으로 나타났으며 1MS와 2MS 배지 에서는 거의 뿌리가 발생하지 않았다. Jadczak et al.(2017)은 끈끈이 주걱에 있어서 1/4MS 에서 뿌리발생이 가장 양호하다 고 하였다. 끈끈이주걱에 있어서 낮은 농도의 무기염류 농도 및 절편의 형태가 식물체 재분화 및 생장에 중요한 영향을 미치는 것으로 판단된다. 끈끈이주걱과 같은 식충식물은 질 소원이 부족한 토양에서 자라기 때문에 생육하는 동안 작은 벌레나 곤충을 잡아 필요한 영양분을 흡수하는 특성을 가지 고 있어 무기염류 특히 질소원의 농도가 낮은 조건이 식물체 재생과 생장에 효과적인 결과를 보인다고 하였다(Kim et al. 2006).

액체배지에서의 식물체 재분화

액체배지가 식물체 재분화에 미치는 영향을 알아보고자 MS 배지를 기본으로 하여 무기염류의 농도 및 잎의 부위에 따른 절편의 형태를 달리하여 실험을 수행한 결과 다음과 같다 (Table 2). 액체배지에서의 생존율은 모든 처리에서 100%로 고체배지에서의 생존율보다 높게 나타났다. 식물체 재분화율 은 1/2MS배지의 사각형으로 자른 엽신에서 100%로 가장 높 게 나타났으며 배지의 무기염류 농도에 관계없이 엽신+엽병 보다는 사각형으로 자른 엽신에서 재분화율이 양호한 경향을 보였다. 신초수는 1MS보다는 1/4MS와 1/2MS배지에서 높은 경향이었으며 1/4MS와 1/2MS배지에서는 사각형으로 자른 엽 신과 엽신+엽병의 중앙에 칼집을 낸 절편에서 약간 더 높게 나타났다. 신초장은 1/4MS배지의 사각형으로 자른 엽신에서 1.5cm로 가장 길었으며 무기염류의 농도가 높은 1MS배지에 서 신초의 생장은 감소하는 경향을 보였다. 뿌리발생률은 1/4MS와 1/2MS배지보다 1MS배지에서 높게 나타났으나 1MS 배지의 절편체간에는 유의성이 없었다. 고체배지와 액체배지 를 비교해 볼 때, 액체배지에서 5주간 배양한 결과가 고체배 지에서 8주간 배양한 결과(Table 1)보다 좋은 것으로 나타나 끈끈이주걱의 재분화를 위해서는 액체 배양이 효율적인 것으 로 판단된다. 액체배지를 이용하면 고체배지보다 배지의 양분 을 충분히 이용하여 생육이 휠씬 촉진되는 효과가 있으나 절 편체가 액체 속에 잠겨있어 식물체의 과수화 현상이 일어난 다. 그러나 본 실험에서는 유리화 현상이 전혀 나타나지 않아 식물체를 재분화시키는데 액체배지의 이용은 전혀 문제가 없 는 것으로 보인다. 끈끈이주걱(D. rotundifolia)의 신초 증식에 있어서 액체배지가 고체배지보다 월등히 효과적이며 절편의 재생 능력은 액체배지에서 증가한다고 하였으며(Wawrosch et al. 2009) D. anglica와 D. binata의 경우도 같은 결과를 보였 다(Kawiak et al. 2003). 끈끈이주걱의 기존 연구에서는 엽신+ 엽병을 절편체로 이용했으나 본 실험의 결과 액체배지에서 엽 절편체로는 사각형으로 자른 엽신 그리고 엽신+엽병 그대로 를 이용할 경우에는 중앙에 칼집을 내면 식물체 분화율이 좀 더 증가되는 것을 알 수 있었다.

액체배양 시 광조건의 영향

끈끈이주걱의 액체배양 시 명·암배양 및 MS배지의 무기염 류 농도가 재분화 및 생장에 미치는 영향을 알아본 결과 다음 과 같다(Table 3, Fig. 2). 배양 5주후 액체배지에서 생존율과 재분화율은 모든 처리에서 100%로 높게 나타났다. 그러나 5주 간 배양하는 동안 배양 초기에 명배양보다는 암배양에서 신초 가 빨리 나오는 경향을 볼 수 있으며 명배양에서의 절편체는 2주가 지나서야 신초가 나오기 시작하는 것을 관찰할 수 있었 다. 신초수는 암배양 2주 후 명배양 3주 처리와 암배양 4주 후 명배양 1주 처리의 1/4MS에서 각각 3.6개, 3.5개로 가장 많았다. 신초수의 증가는 배양기간의 암과 명배양의 처리 기 간에 따라 그리고 배지 내의 무기염류의 농도에 따라 영향을 받는 것으로 나타났다. 신초장은 암배양 4주 후 명배양 1주 처리가 다른 처리에 비해 높게 나타났으며 특히 1/4MS와 1/2MS배지에서 각각 2.2cm, 2.1cm로 가장 높게 나타났다. 배 양기간에 걸쳐 암배양이 명배양의 기간보다 길어질수록 신초 길이생장이 양호한 것으로 보였으며 배지 내의 무기염류 농도 가 높을수록 신초의 생장은 감소하는 것으로 나타났다. 생체 중은 명배양 5주처리의 1/4MS배지에서 1960mg으로 가장 높 게 나타났으며 명배양이 길어질수록 그리고 무기염류 농도가 낮을수록 생체중은 증가하는 경향을 보였다. 광이 식물체의 생장에 큰 영향을 미친다는 것은 이미 알려져 있다(Cho et al. 2012). Kim et al.(2006)은 갈대끈끈이주걱(D. spatulata sp. Tokaiensis)에 있어서 엽절편체 배양 시 생존율은 암배양에서 배지의 농도가 낮을수록 높았고 신초수는 암배양보다 명배양 에서 높은 경향을 보인다고 하였다. 본 실험과 상반되는 결과 를 보였으나 이는 배양기간 중에 명･암배양을 교호적으로 처 리한 데서 기인한 것으로 보인다. Lee et al.(1999)은 국화 엽 절편체 배양의 경우 식물체 재분화에 배양초기 1주간 암처리 가 명처리에 비해 식물체 재생률 및 절편체당 신초수에서 현 저히 증가한다고 보고하였고 Jung et al.(2011)은 무스카리 잎 절편을 2주간 암배양 후 명배양하였을 때 자구의 형성 및 생 육이 가장 양호하였다고 보고하였다. Lee and Kwon(1999)은 파리지옥 엽절편체를 1, 2, 3, 4주간 암배양 후 명배양으로 옮 겨 배양한 결과 암배양 기간이 증가할수록 식물체 재생 및 생 장이 왕성하다고 보고하였다. 그러나 본 실험에서 암 4주후 명 1주처리에서 자란 신초들은 엽신과 엽병이 가늘어지는 경 향을 보여 그 결과 신초장이 증가한 것으로 보이므로 생장 상 태를 고려한다면 암 2주처리후 명 3주처리의 1/4MS배지가 가 장 좋은 것으로 판단된다. 식물체 재생과 생장을 위해 배양 초기 암처리는 효과적인 것으로 보이나 암처리 기간에 대한 반응은 식물체마다 다르게 작용하는 것으로 보인다. 뿌리발생 률은 각 처리의 1/2MS배지에서 양호한 것으로 보였으며 암배 양의 기간이 짧아지고 상대적으로 명배양 기간이 길어질수록 높아지는 경향을 보였다.

Cytokinin의 종류 및 농도의 효과

끈끈이주걱의 액체배양 시 cytokinin의 종류에 따른 각각의 농도 효과를 알아보기 위한 결과는 다음과 같다(Table 4). Kinetin보다 BA가 식물체 재분화 및 생장에 효과적인 것으로 나타났다. Lee(2005)도 끈끈이주걱 엽절편체에서 kinetin보다 BA 를 첨가한 배지에서 신초 증식이 더욱 촉진된다고 보고하 였다. BA첨가된 배지에서는 신초 생장이 촉진되었으나 kinetin 을 첨가한 배지에서는 식물체로 전혀 재분화되지 않고 갈변하 는 것을 관찰 할 수 있었다. 낮은 농도의 BA를 첨가한 배지에 서는 일반적으로 생장이 양호하였으나 처리상의 고농도인 BA 1.0mg·L^-1 배지에서는 전혀 재분화하지 않았다. 신초수도 낮 은 농도의 BA에서 증가하는 경향을 보였으며 신초장도 같은 결과를 보였다. BA 농도가 높아질수록 신초장이 짧은 경향을 보여 BA 처리가 줄기신장을 억제한다는 많은 연구 결과들과 유사하였다(Shim and Ha 1997). 또한 cytokinin이 첨가된 배 지에서 뿌리는 전혀 발생하지 않았다. 본 실험에서는 오히려 cytokinin이 첨가된 배지보다는 첨가되지 않은 배지에서 신초 및 뿌리생장이 양호한 것으로 나타났다. Bobák et al.(1995) 은 D. rotundifolia의 경우 생장조절제가 첨가되지 않은 배지 에서 분화율이 가장 높다고 보고하였고 Kawiak et al.(2003) 은 D. binata의 경우 생장조절제가 첨가되지 않은 배지에서 신초수가 가장 많이 분화하였다고 보고한 결과와 유사하였다. 끈끈이주걱(D. rotundifolia)에 있어서 zeatin 2μM이 첨가된 배지가 cytokinin이 전혀 첨가하지 않은 대조구에 비해 신초 수가 월등히 증가된다고 하였으며 BA 2~10μM 보다 보다 kinetin 2~10μM이 신초생장에 효과적이라고 하는 연구 결과 (Wawrosch et al. 2009)를 볼 때 본 실험에서는 상반된 결과 를 보였다. Jayaram and Prasad(2007)는 D. indica에 있어서 BA 0.1mg·L^-1와 kinetin 0.5~1.0mg·L^-1 모두 신초생장에 효 과적이라 하였다. Cytokinin의 종류 및 농도에 따라 그리고 식 물체 종에 따라 그 결과가 다른 양상을 나타내고 있는 것으로 보인다. 따라서 본 실험에서는 끈끈이주걱의 액체배양 시 cytokinin은 재분화 및 생장에 큰 효과가 없는 것으로 보였으 나 본 실험과 상이한 결과는 cytokinin의 농도차이에서 기인 된 것으로 더 세부적인 농도에서 추가적인 연구가 필요한 것 으로 판단된다.

본 연구의 결과, 끈끈이주걱의 잎 절편체로는 사각형으로 자른 엽신과 엽신+엽병(중앙에 칼집)처리가 식물체 재분화에 좋았고 무기염류농도, 배양방법, 광조건이 끈끈이주걱의 기내 배양시 식물체 재분화와 생장 및 형태형성에 분명히 영향을 미치는 것으로 보였다. 끈끈이주걱 잎 1개를 1/4MS~1/2MS 액 체배지의 암 2주처리 후 명 3주처리에서 1년 동안 계대배양 할 경우에 약 100,000개 이상의 식물체를 생산할 수 있을 것 으로 생각된다.

조직배양 시 적절한 배지, 배양방법 및 cytokinin의 선택, 그리고 광조건 등은 기내 신초의 정상적인 생육을 위해 필요 하며 향후 기내 신초의 소질을 높일 수 있는 요인이 될 수 있 어 본 실험의 결과는 향후 끈끈이주걱의 기내 대량 증식을 위 한 자료로 활용할 수 있을 것이다.

초 록

본 연구는 한국에 자생하는 대표적인 식충식물인 끈끈이주 걱(Drosera rotundifolia)에 있어서 기내 대량번식 체계를 확립 하기 위해 잎 부위별로 절편체(엽신, 사각형으로 자른 엽신, 엽병, 엽신+엽병, 엽신+엽병의 중앙에 칼집)를 달리하여 신초 증식 및 재분화에 적합한 배지농도(1/4MS, 1/2MS, 1MS, 2MS) 및 배양방법(고체 및 액체배지 그리고 암 4주후 명 1주, 암 2 주후 명 3주, 명 5주처리)을 구명하고자 하였다. 고체배지의 경우, 식물체 재생율과 신초수는 1/4MS~1/2MS배지에서 사각 형으로 자른 엽신 절편(100%, 1.8개)과 엽신+엽병 절편(100%, 1.6~1.8개)에서 가장 높게 나타났다. 액체배지의 경우, 식물체 재생율은 1/2MS배지의 사각형으로 자른 엽신 절편에서 100%, 신초수는 1/4MS와 1/2MS배지의 사각형으로 자른 엽신과 엽 신+엽병(중앙-칼집) 절편에서 2.6~2.7개로 높게 나타났다. 고 체배지와 액체배지를 비교해 볼 때, 액체배지에서 5주간 배양 한 결과가 고체배지에서 8주간 배양한 결과보다 좋은 것으로 나타나 끈끈이주걱의 재분화를 위해서는 액체배양이 효율적 인 것으로 판단된다. 배양조건에서는 암 4주 후 명 1주 처리 와 암 2주 처리 후 명 3주 처리의 1/4MS배지에서 신초수가 각 각 3.5개, 3.6개로 가장 높았으나 생장상태를 고려한다면 암 2 주처리후 명 3주처리의 1/4MS배지가 가장 좋은 것으로 판단 된다. 본 실험에서는 오히려 cytokinin이 첨가된 배지보다는 첨가되지 않은 배지에서 신초 및 뿌리생장이 양호한 것으로 나타났다.

추가 주요어: 절편체, 광조건, 액체배지, 무기염류, 식물체 재 분화, 반고체배지