서 언

스트레스나 불규칙한 생활습관이 각종 질병과 성인병에 영향 을 미치는 원인의 하나로 꾸준히 지적되면서 식물과 식물의 향 이 가지고 있는 스트레스 완화효과와 정서안정, 이완효과 등에 대한 관심이 높아지고 있다. 식물의 향은 분자량이 작아 휘발성 이 강한 monoterpene계 화합물이 대부분이며, monoterpene은 식물의 이차대사산물로 항균, 항산화, 항암, 혈압강하, 혈관 이 완 등 다양한 약리학적 특성을 갖고 있다(Park et al. 2010; Santos et al. 2011). 식물에서 발생되는 향기화합물들은 호흡 시 비강을 통해 후각상피에 도착하게 되며, 이후 공진에 의해 후각수용체 신경세포에 전달되어 향으로 감지된다(Pichersky 2004). 이와 같은 경로로 대뇌 변연계로 전달된 방향화합물들은 신경세포를 자극하게 되는데, 이때 α-pinene, 1,8-cineole, limonene 등의 특정 방향화합물은 부교감신경을 활성화시키고, 교감신경 활성을 억제시켜 혈압, 맥박, 심박수 감소 등 자율신경 계에 영향을 준다(Gomes et al. 2010; Santos et al. 2011). 또한 스트레스 호르몬으로 알려진 cortisol 농도를 떨어뜨리고(Toda and Morimoto 2008; Song 2013), 교감신경계에 의해 방출되는 주된 신경전달물질인 노르아드레날린 수치를 감소시켜(Li 2010) 스트레스를 완화시킨다. 이와 같은 식물 방향화합물의 이완, 진정효과(Jo et al. 2013; Menezes et al. 2010; Park et al. 2010)와 우울감 감소 등과의 연관성은 여러 연구를 통해 보고된 바 있으며(Jin et al. 2014; Souto-Maior et al. 2011), 원예치료나 원예활동에서의 이용이 기대된다. 특히 원예치료에 사용된 식물재료의 체내에서 이들 기능성 방향화합물이 증가된 다면 원예치료활동 시 치료효과의 증대에 도움이 될 것이다. 식물은 스트레스를 받으면 다양한 방어기작이 나타나며, 이는 식물대사의 변화로 연결되어 2차대사산물인 monoterpene의 생합성에도 관여한다(Vickers et al. 2009). 생리활성물질 처리 나 스트레스로 유발된 식물의 방어기작을 이용하기 위한 연구 는 다수 있으며(Huang et al. 2009; Selmar and Kleinwachter 2013), 염스트레스와 관련이 있는 염화나트륨(NaCl)과 신호전 달물질인 살리실산(Salicylic Acid, SA), 살리실산의 합성을 촉진 시키는데 관여(Kang et al. 2008)하는 것으로 알려져 있는 과산 화수소(Hydrogen Peroxide, H₂O₂) 등이 있다. H₂O₂와 SA의 처 리는 식물체내에서 활성산소종에 의한 산화스트레스(Lamb and Dixon 1997; Orozco-Cárdenas et al. 2001)와 기공폐쇄(Klessing and Malamy 1994) 등을 유발하는데, 식물호르몬 SA는 스트레 스 조절 호르몬으로 알려진 jasmonic acid와 에틸렌 생합성 조 절을 통해 식물 스트레스 반응 메커니즘 및 식물 내 플라보노이 드와 같은 이차대사물질의 함량을 조절(Klessing and Malamy 1994)하는 것으로도 알려져 있으며, 활성산소종으로 항산화효 소 발현에 관여하는 H₂O₂는 산화스트레스와 관련(Lamb and Dixon 1997; Orozco-Cárdenas et al. 2001)한 이차대사산물의 증가에 영향이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 스트레 스 완화와 진정효과 등의 치료효과가 뛰어나다고 보고된 α -pinene과 1,8-cineole을 중심으로, 살리실산(SA)과 과산화수소 (H₂O₂) 등의 처리가 식물체에서 이들의 함량에 미치는 영향을 밝혀 원예치료 활동에 직접적으로 적용하기 위해 최대증가 시 간과 처리 농도, 방법 등에 대한 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

식물재료 및 처리내용

식물재료는 화훼작업과 원예치료활동 시 잎 소재로 주로 이용 되며, 기능성방향화합물의 함량이 높은 유칼립투스(Eucalyptus pulverulenta)를 사용하여 침지 또는 살포처리 후 방향화합물을 추출하여 분석하였다. 유칼립투스 가지는 길이 17cm로 균일하 게 잘라 사용하였으며, 1가지 당 잎의 개수는 16개로 제한하였 다. 모든 실험과정은 서울시립대학교 환경원예학과 실험실 (25℃ ± 2)에서 진행되었다.

침지처리

과산화수소(H₂O₂, Junsei chemical Co., Ltd., Japan)를 증 류수에 희석하여 0.3, 0.5, 그리고 1%로 조정한 수용액과 살 리실산(salicylic acid, Sigma-Aldrich Inc., USA)을 0.1mM과 1mM로 녹인 수용액 300mL를 500mL 비이커에 농도별로 3개 씩 담은 뒤(N = 3) 유칼립투스 가지를 꽂았다(농도별로 H₂O₂ 3처리, SA 2처리 총 5처리, 3반복). 침지처리 전(0h)과 처리 후 30분(0.5h), 1시간(1h), 2시간(2h), 4시간(4h) 등 총 5회 각 비이커별로 잎을 채취하여 방향화합물분석에 이용하였다.

살포처리

유칼립투스의 가지를 300mL의 물을 채운 500mL 3개씩에 꽂은 뒤, 1% H₂O₂ 수용액과 0.1mM SA 수용액(3mL)을 분무 기를 사용하여, 1시간마다 잎 채취 직후 총4회 살포하였다. 최 초 분무 직전(0h), 분무 30분 (0.5h), 1시간(1h), 2시간(2h), 4시간(4h) 후 총 5회 살포직전에 잎을 채취하여 방향화합물분 석에 이용하였다.

추출 및 분석 방법

방향화합물의 추출

각 처리별 향기성분함량의 변화를 알아보고자 Owens et al.(1998)의 방법에 따라 채취된 식물 시료들을 잘게(3mm ± 1.5mm) 잘라 0.3g씩 50mL Vial에 옮기고, 30mL Hexane(Hexane ≥ 97.0%, Sigma-Aldrich Inc., USA) 용액에 침지하여 추출하였다. 이때 침지온도는 25℃, 침지시간은 48시간(Kazlauskas et al. 2011) 으로 맞추었다.

방향화합물 분석

향기성분분석은 수소염이온화검출기(FID)가 설치된 Gas Chromatography(GC Plus 2010, Shimadzu Corp., Japan)에 SH-Rtx-1 Column(60m × 0.25mm × 0.25μm)을 장착하여 사용 하였다. 분리된 향기성분의 동정을 위한 표준물질로는 analytical standard(sigma-aldrich) 등급의 (+)-⍺-pinene, 1,8-cineole을 사용하였다. 초기 오븐 온도는 60℃로 3분간 유지한 후에 5℃ /min의 속도로 150℃까지 상승시켜 6분간 유지하였다. monoterpene은 비교적 빨리 분리되므로 이후 30℃/min으로 200℃로 올려 5분간 유지하여 분석시간을 단축하였다. Carrier gas는 helium(1mL/min)을 사용하였다.

통계검정방법

H₂O₂와 SA 처리에 따른 시간별 종속변인 α-pinene과 1,8-cineole 의 변화를 알아보기 위해 처리(무처리, H₂O₂, SA 처리)와 측정시간 (30분후, 1시간후, 2시간후, 4시간후)을 독립변인으로 하는 Repeated ANOVA를 실시하였다. 각 요인별 변화에 따른 차이검증 을 위해 사후분석으로 독립 t-test를 실시하였다. 통계검정방법은 IBM SPSS(version 25, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용해 수행하였으며, 평균과 표준오차 값으로 제시하였다.

결 과

H₂O₂ 침지처리에 따른 monoterpene 함량변화

유칼립투스에 H₂O₂ 수용액 0.3, 0.5, 1%를 각각 처리한 후 시간별로 monoterpene 함량변화를 분석한 결과(Table 1), α-pinene과 1,8-cineole 모두 처리시간별 유의한 차이를 보였으 며(p = 0.025, p = 0.020), 처리시간과 처리농도 간에도 유의한 상호작용 효과를 나타냈다(p = 0.038, p = 0.023). 사후분석으로 실시한 독립 t-test결과, α-pinene의 함량(mg･L^-1)은 0.3% H₂O₂ 처리 시 2.62 ± 0.19에서 3.42 ± 0.18로 2시간 뒤 유의하게 증가하였으며(p = 0.037), 0.5% H₂O₂ 처리 시 역시 2시간 뒤 2.62 ± 0.19에서 3.76 ± 0 .27로 유의하 게 증가하였다(p = 0.025). 1% H₂O₂ 처리 시에도 30분과 4시간 뒤 각각 2.90 ± 0.35과 2.93 ± 0.15으로 증가하였으나 유의성이 인정되지는 않 았다(p = 0.529, p = 0.270). 1,8-cineole 함량(mg･L^-1)은 0.3% H₂O₂ 처리 4시간 뒤와 0.5% H₂O₂ 처리 2시간 뒤 38.22 ± 1.98에 서 45.24 ± 6.24과 44.17 ± 1.66로 증가하였으나 유의성이 인정 되지는 않았다. 1% H₂O₂ 처리 시 1,8-cineole은 38.22 ± 1.98에 서 49.72 ± 2.58로 유의하게(p = 0.024) 증가하였다.

SA 침지처리에 따른 monoterpene 함량변화

유칼립투스에 SA 수용액 0.1mM과 1mM을 각각 처리한 후 시간별로 monoterpene 함량변화를 분석한 결과(Table 2), α-pinene과 1,8-cineole 모두 처리시간별 유의한 차이를 보였 으며(p = 0.004, p = 0.001), 1,8-cineole은 처리농도 간에도 유의한 차이를 보였다(p = 0.027). 또한, 처리시간과 처리농도 간 유의한 상호작용 효과를 나타내어(p = 0.001, p = 0.008), 사후분석으로 실시한 독립 t-test결과 α-pinene 함량(mg･L^-1)은 0.1mM SA 처리 2시간 뒤 1.62 ± 0.32에서 5.48 ± 0.82로 유 의하게 증가하였으며(p = 0.012), 1mM SA 처리 1시간 뒤와 4시간 뒤, 1.62 ± 0.32에서 3.49 ± 0.55와 3.53 ± 0.38으로 유의하게 증가하였다(p = 0.042, p = 0.019). 1,8-cineole 함량 (mg･L^-1)은 0.1mM SA 처리 2시간 뒤 44.44 ± 3.25에서 69.66 ± 7.15으로 유의하게 증가하였으며(p = 0.033), 1mM SA 처 리 1시간 뒤와 4시간 뒤 44.44 ± 3.25에서 71.94 ± 5.11과 78.96 ± 5.11으로 유의하게 증가하였다(p = 0.010, p = 0.026). 사후분석으로 실시한 독립 t-test결과 α-pinene은 1% H₂O₂ 수 용액 살포처리 30분 뒤 2.45 ± 0.49에서 2.94 ± 0.29으로 증 가하였으나 유의성이 인정되지는 않았다.

H₂O₂와 SA 살포처리에 따른 monoterpene 함량변화

유칼립투스 잎에 H₂O₂ 수용액 1%와 SA 수용액 0.1mM을 살포처리한 후 시간별로 monoterpene 함량변화를 분석한 결 과(Table 3), α-pinene과 1,8-cineole 모두 처리시간별 유의한 함량 증가를 보였다(p = 0.002, p = 0.006). 사후분석으로 실 시한 독립 t-test결과 α-pinene 함량(mg･L^-1)은 1% H₂O₂ 수용 액 살포처리 30분 뒤 2.45 ± 0.49에서 2.94 ± 0.2으로 증가하 였으나 유의성이 인정되지는 않았다. 반면에 0.1mM SA 수용 액 살포처리 30분과 1시간 뒤 α-pinene 함량(mg･L^-1)은 1.62 ± 0.32에서 3.91 ± 0.32과 3.01 ± 0.15으로 각각 유의하게 증 가하였고(p = 0.007, p = 0.017), 1,8-cineole 함량(mg･L^-1) 역 시 1mM SA처리 30분 뒤에 44.44 ± 3.25에서 87.91 ± 4.32으 로 크게 증가하였다(p = 0.001).

고 찰

원예치료의 효과에는 원예활동과 함께 향이나 색과 같은 식 물 자체의 기능도 중요한 역할을 한다. 식물의 특정 향은 대 상자의 긍정적 행동변화를 유도하고(Baik and Eom 2015), 스 트레스와 우울감 감소, 진정, 이완에 도움이 되며(Gomes et al. 2010; Jin et al. 2014; Souto-Maior et al. 2011), 심리적 안 정감(Kim 2016; Shin et al. 2010; Sowndhararajan et al. 2015) 과 불안을 해소(Lee et al. 2011; Moreira et al. 2014)하는 등 의 정서적 효과가 크다. H₂O₂와 SA 처리를 통한 식물의 기능 성방향화합물 증가가능성은 일반인을 대상으로 한 스트레스 완화와 심리안정 효과의 적용에 도움이 될 것이며, 우울증 환 자들을 대상으로 한 원예치료 활동 시 비 약물치료의 하나로 약물과 병행치료의 가능성을 열어 식물의 향을 이용한 원예 치료활동의 적극적 적용과 치료효과 증대에도 도움이 될 것 이다.

H₂O₂ 처리에서는 0.5%를 2시간 처리했을 때 α-pinene의 함 량(mg･L^-1)이 가장 크게 증가하였으며(43.51%, 2.62에서 3.76), 1%의 H₂O₂를 1시간 처리했을 때 1,8-cineole의 함량(mg･L^-1) 이 가장 크게 증가하였다(30.09%, 38.22에서 49.72). SA 처리 에서는 0.1mM을 2시간 처리했을 때α-pinene의 함량(mg･L^-1) 이 가장 크게 증가하였으며(238.27%, 1.62에서 5.48), 1mM의 SA를 2시간 처리했을 때 1,8-cineole의 함량(mg･L^-1)이 가장 크게 증가하였다(77.66%, 44.44에서 78.96). 또한 1% H₂O₂와 0.1mM SA 수용액을 각각 잎에 분무한 뒤 30분, 1시간, 2시간, 4시간 동안 유칼립투스의 α-pinene과 1,8-cineole의 함량변화 를 분석한 결과 역시 함량증가에 유의한 영향이 있었으며, 0.1mM SA 엽면살포시 α-pinene(141.36%, 1.62에서 3.91)과 1,8-cineole(97.82%, 44.44에서 87.91) 모두 살포 30분 뒤 크 게 증가하였다. 이와 같은 결과는 SA 처리가 monoterpene 생 합성과 방출에 영향을 준다고 보고한 Xu et al.(2011)의 연구 와 같은 경향이었으며, SA 처리가 monoterpene 함량증가에 영향을 준 것으로 판단한다. 식물체가 기계적 상처나 스트레 스를 받게되면 monoterpene 방출과 monoterpene synthase 의 활동을 증가시켜 스트레스나 상처로 인해 손상된 화합물을 대체하는데(Litvak and Monson 1998), 이는 메틸자스몬산 처 리를 통해 모노테르펜 방출량증가를 확인한 Diane et al.(2003) 의 연구와 스트레스 조건 하에서 이차대사산물의 함량증가를 연구한 Bohner et al.(1995)과 Selmar and Kleinwachter(2013) 의 연구 등을 통해 증명된 바 있다. 또한 스트레스를 받은 식 물이 스트레스로부터 회복될 때 일시적으로 휘발성 방향화합 물의 증가가 일어난다(Vickers et al. 2009)는 보고도 있다.

Monoterpene과 천연생성물의 축적은 온도, 광질 및 영양공 급과 같은 성장 조건에 크게 의존하며(Gershenzon 1984), 이 러한 조건들은 장기간 지속적인 영향을 통해 영향을 미치는 반면, H₂O₂와 SA의 처리를 통한 산화스트레스와 기공폐쇄 등 을 통한 일시적인 방향화합물의 증가는 이를 유도하기 위해 2 시간 동안 0.1mM SA 수용액에 줄기를 담가놓거나, 0.1mM SA 수용액을 30분 전 엽면살포하는 것만으로도 스트레스감소 와 진정, 안정효과를 가져오는 monoterpene의 함량증가를 기 대할 수 있다. 이런 점에서 H₂O₂와 SA의 처리는 monoterpene 방출량을 증가시켜 원예치료 프로그램의 치료효과를 높이고, monoterpene의 종류별 증가 조건이 다르므로 대상자나, 적응 증을 감안하여 원예치료의 운용상황과 처리물질을 체계적으 로 활용하는 데 유용한 기초자료가 될 수 있을 것으로 판단된 다. 이번 실험에서는 침지처리 시 α-pinene과 1,8-cineole의 농 도증가 시간과 침지와 분무 등 처리화합물과 농도별 증가시간 이 달랐으나 이를 구명하기엔 실험의 규모에서 처리의 종류와 수준이 많지 않고, 한 가지 작물, 한 품종만을 사용했다는 제한 점이 있었다. 처리 화합물의 농도와 시간에 따라 monoterpenes 함량의 증가와 감소가 다른 상황은 식물체에서 분리된 가지에 서 monoterpene의 전구물질의 양은 제한된 상태에서 지속적 으로 증가할 수는 없었으리라는 점과, 스트레스로 인한 감소 후 발생 등도 고려할 수 있지만, 이번 실험에서는 원인구명을 할 수 없었다. 이들 제약점이나 미흡한 점을 밝히기 위해서는 원예치료재료로 사용되는 식물의 품종간, 종간 비교와 적정 화합물 및 농도 등 처리방법에 대한 폭넓은 실험이 필요하며, 이를 통해 원예치료의 효율이 더욱 높아지리라 기대한다.

초 록

본 연구는 유칼립투스(Eucalyptus pulverulenta) 잎에서 치 료적 효과가 큰 α-pinene과 1,8-cineole 함량증가에 미치는 H₂O₂와 SA 처리의 영향에 대해 알아보기 위하여 수행하였다. 유칼립투스가지를 H₂O₂ 수용액(0.3, 0.5, 1%)과 SA 수용액(0.1, 1mM)에 침지하거나 잎에 엽면살포(0.1mM SA, 1% H₂O₂)한 뒤 시간흐름(0, 0.5, 1, 2, 4시간)에 따른 α-pinene과 1,8-cineole 의 함량변화를 분석한 결과, 침지처리에서 유칼립투스 잎의 α-pinene 함량(mg･L^-1)은 0.1mM SA에 2시간 침지 후 1.62에 서 5.48로 크게 증가하였으며(238.27%, p=0.012), 1,8-cineole 함량(mg･L^-1)은 1mM SA에 4시간 침지 후 44.44에서 78.96으 로 크게 증가하였다(77.66%, p=0.026). 살포처리에서는 0.1mM SA를 엽면살포 30분 후 α-pinene 함량(mg･L^-1)은 1.62에서 3.91로(141.36%, p=0.007), 1,8-cineole 함량(mg･L^-1)은 44.44에 서 87.91로 증가하였다(97.82%, p=0.001). α-pinene과 1,8-cineole 모두 살포처리 30분 뒤 크게 증가하여, 엽면살포가 짧은 시간 내에 방향화합물을 증가시키는데 침지처리보다 효과적이었으 며, H₂O₂와 SA 처리는 α-pinene과 1,8-cineole의 함량증가에 유의한 영향이 있었다. 또한, SA의 처리가 H₂O₂보다 방향화 합물 함량증가에 더 효과적이었으며, 유칼립투스 가지의 경우 원예치료 2시간 전에 0.1mM SA 용액에 담그거나 30분 전에 잎에 살포하면 monoterpene의 유칼립투스 함량이 크게 증가 되었다.

추가 주요어: 원예치료, 향기화합물, 식물 향, 휘발성 성분