서 언

1990년대 후반부터 교잡육종방법의 한계를 넘어 유전공학적 방법에 의해 개발된 콩, 면화 등 작물의 해충 및 제초제 저항성 genetic modified(GM) 품종이 상업화되기 시작하였고, 형질전환 품종의 점유율은 증가하여 2012년 세계 종자시장의 35%를 차지하 였다. 화훼류 중에서는 카네이션과 장미의 화색변형 형질전환 품종이 각각 1996년과 2009년에 호주의 Florigene사와 일본의 Suntory사에서 개발되어 2017년 5월 현재 호주 등 8개국 122개 도매 점포와 일본의 북해도 등 8개 지역 3,480개 점포에서 판매중 이다(Lee 2017).

식물의 화색은 플라보노이드, 카로티노이드, 베타라인 등 의 색소에 의해 결정되며, 이 중 유관속식물의 액포에 축적되 는 2차 산물로서 chalcone, flavonone, flavone, flavonol, anthocyanin 등의 플라보노이드가, 플라보노이드 중에서는 anthocyanidin으로부터 생성되는 anthocyanin이 화색 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Anthocyanidin에는 flavonoid 3-hydroxylase에 의해서 합성되는 pelargonidin(오렌 지색), flavonoid 3'-hydroxylase에 의해서 합성되는 cyanidin(적 색), flavonoid 3',5'-hydroxylase(F3'5'H)에 의해서 합성되는 delphinidin(보라색) 등이 있다(Tanaka et al. 2010). 화색 발현 조절 유전자의 도입에 의해 개발된 형질전환 화색변형 화훼 품종은 고부가 창출 효과가 매우 커서 일반 장미 품종의 가격이 100￥/본이 었을 때 형질전환 장미 품종 ‘APPLAUSE’는 4,200￥/본이었다(Lee 2011). 이러한 이유로 형질전환기술에 의해 화색을 변형시킨 식물체를 개발하고자 하는 연구는 최근에도 끊임없이 이루어지고 있다(Lee 2015). He et al.(2013)은 선홍색 국화 형질전환체를 개발하고자 국화 ‘Lijin’ 분홍색 품종의 시아니딘 합성 유전자 CmF3’H의 발현을 억제시키고 시네나리아(Senecio cruentus) 유 래 flavonoid 3´,5´-hydroxylase 유전자 F3′5′H 는 과발현 시켜 선홍색 형질전환체를 획득하였다고 보고하였다. 장미 형질전환 품종을 개발하여 상업화에 성공한 일본의 SUNTORY사 기초과학 연구소에서는 2014년 8월 21일부터 2일간 일본의 모리오카현 아이나센터에서 개최된 제32차 일본 식물세포분자생물학회에서 화색이 변경되고 F3 ´5 ´H 유전자가 1 copy만이 도입된 새롭게 카네이션 형질전환체를 획득하였고, 획득 형질전환체의 상업화하 기 위하여 필요한 분자생물학적 분석 연구 결과를 발표한 바 있다(Lee 2015). 또한 일본의 SUNTORY사 Global Innovation Center에서는 2014년 10월 10일에 일본기초생물연구소와 카고시 마 대학과 공동으로 연구하여 환상적인 노란색 나팔꽃을 개발하였 다고 보고하였다(Lee 2015). Nakamura et al.(2015)은 담자색의 anthocyanin 색소를 축적시키는 것으로 알려진 anthocyanin 3′,5′-O-methyltransferase 유전자인 S-adenosylmethionine 을 토레니아 꽃잎으로부터 분리 동정한 후 장미에 도입하여 획득한 형질전환체의 화색이 마젠타색에서 진핑크로 변형되 었다고 보고하였다. 최근에는 Noda et al.(2017)이 나비콩으로부 터 분리한 UDP(uridine diphosphate)-glucose:anthocyanin 3´,5´- glucosyltransferase 유전자 CtA3 ′5 ′GT와 초롱꽃으로부터 분리 한 F3´5´H 유전자 CamF3 ′5 ′H를 국화 국화 ‘Taihei’ 등 7품종(계통) 에 도입하여 선토리사에서 개발한 보라색에 가까운 파란색 장미 형질전환 품종 ‘APPLAUSE’와는 달리 진정한 파란색 국화 형질전 환체를 획득하였다고 보고하였다.

기 연구를 통해 우리 연구팀에서도 화색변형 화훼 형질전환체 개발을 위한 유전자를 개발하고자 클레마티스로부터 F3 ′5 ′H 유 전자를 분리 동정하여 ClF3 ′5 ′H로 명명한 후 클레마티스 화 종별 발현양상에 관한 연구결과를 보고한 바 있다(Kim et al. 2016). 본 연구는 ClF3 ′5 ′H를 페튜니아에 도입하여 그 기능 을 확인하고자 수행하였다.

재료 및 방법

식물 형질전환용 벡터제작 및 페튜니아 형질전환

ClF3 ′5 ′H 유전자의 기능을 확인하고자, 전장의 암호화 영역의 유전자를 binary vector pCAMBIA2300의 cloning site에 삽입한 후(Fig. 1) Agrobacterium tumefaciens GV3101에 클로닝하였다. 기내 파종 후 80~90일 경과한 ‘Dream’s Red’식물체의 어린잎을 5㎜ × 5㎜로 절단한 110개 절편체를 전배양 배지[Murashige & Skoog component(Murashige and Skoog 1962) + indole acetic acid(IAA) 2mg·L^-1 + benzyl amino purine(BAP) 1mg·L^-1, agar 7g·L^-1, pH 5.7]에서 1일간 배양한 후, ClF3'5'H 유전자를 삽입하고 있는 아그로박테리움과 공동배양을 실시하였다. 2일 후, 전배양배지 에 cefotaxime 400mg·L^-1 첨가한 영양선발배지로 옮겨 7일간 배양 하였고, 이후 영양선발배지에 kanamycin 50mg·L^-1 과 100mg·L^-1 이 포함된 1, 2차 선발배지로 옮겨 재분화 신초를 선발 후 발근배지 에 옮겨 발근을 유도하였다.

ClF3′5′H 유전자 도입 페튜니아 식물체의 PCR 및 서던분석

2차 선발배지에서 발근된 51개체의 도입 목표유전자의 도입 여부를 확인하기 위하여 polymerase chain reaction(PCR) 분석을 실시하였다. PCR분석을 위한 DNA추출은 DNeasy Mini Plant Kit (Qiagen, USA)을 이용하였고, DNA정량은 NanoVue(GE healthcare, UK)를 이용하였다. PCR반응은 DNA 40~100ng, dNTP 0.2mM, ClF3 ′5 ′H 유전자 특이 primer 10pmoles [forward primer 5′-TCCATGCCTCATGTTGCG-3′, reverse 5′-CAAGTGTCCCCAACATGT-3′], Taq 0.2U 등을 혼합한 20μL을 95℃ 1분, 55℃ 또는 60℃ 1분, 72℃ 1분 35 또는 40회 증폭한 후, loading star(DYNEBIO, Korea) 를 섞어 1% agarose gel상에서 전기영동하여 UV하에서 유전자 도입 여부를 확인하였다. PCR 분석에 의해 ClF3 ′5 ′H 유전자의 도입이 확인된 식물체에 도입 유전자의 copy 수를 확인하고자 서던분석을 실시하였다. 서던분석을 위한 DNA농도는 NanoVue (GE healthcare, UK)로 측정 후 40μg의 DNA를 사용하였고, 100 units의 EcoRI 처리 후 0.5X TBE 용액에 담긴 0.9% agarose gel에 로딩시킨 다음 30V로 17시간 running하였다. 전기영동 후 agarose gel에 전개된 DNA는 nylon HybondTM-N + membrane (Amersham Life science, UK)에 capillary transfer 방법으로 블롯 팅하였다. 탐침은 ClF3 '5 'H 유전자가 삽입되어 있는 pCAMBIA2300 벡터의 PCR 산물 DNA 30ng을 시료로 RedyprimeⅡ^TM Random Prime labeling System(Amersham Life science, UK)을 사용하여 제작하였다. Hybridization과 블롯팅된 membrane 세척은 표준 화된 방법에 따라 수행하였다(Southern 1975). 표지인식을 위해 서는 BAS-1800Ⅱ Bio-Imaging analyzer(FUJIFILM, Japan)을 사용 하였다.

ClF3 ′5 ′H 유전자 도입 확인 페튜니아 식물체의 노던 분석

도입유전자 ClF3 ′5 ′H의 정상적인 발현을 확인하기 위하여 노던분석을 실시하였다. RNA 추출은 Trizol(Invitrogen, USA)을 이용하여 형질전환 22계통의 잎으로부터 추출하였다. RNA농도 는 NanoVue(GE healthcare, UK)로 측정하였고, 각 샘플당 30μg 의 RNA를 1× MOPS buffer와 6.3%(w/v) formaldehyde가 포함된 1%(w/v) agarose gel상에서 100V로 1시간 전개시켰다. 이후 과정은 서던분석 방법과 동일하게 수행하였다.

ClF3 ′5 ′H 유전자 도입 확인 페튜니아 식물체 꽃 특성 조사

PCR 및 서던분석에 의해 ClF3 ′5 ′H 유전자 도입이 확인된 49개체를 순화시킨 후 온실로 이동하였으며, 재배관리를 통해 개화 시 특성 조사는 Color Chart(Royal Horticultural Society, Fifth Edition)와 신품종 심사를 위한 페튜니아 특성조사요령 에 준하여 수행하였다.

꽃 특성 변형 확인 ClF3 ′5 ′H 유전자 도입 페튜니아 식물체의 RT-qPCR 분석

ClF3′5′H 유전자 도입 페튜니아 형질전환체의 변형된 꽃 특성이 도입유전자인 ClF3 ′5 ′H의 발현에 의한 것인지를 확인하고자 실시간 유전자 발현분석(Reverse Transcription-quantitative PCR, RT-qPCR)을 실시하였다. RNeasy Mini Plant Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 형질전환체와 ClF3 ′5 ′H 형질전환체 7계통의 꽃잎, 화심, 암술기관 (암술머리~암술대) 으로부터 total RNA를 추출한 후, 추출액에 혼입된 genomic DNA(gDNA) 제거 및 cDNA 합성을 위해 RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara, Japan)를 사용하였 다. gDNA를 제거하기 위하여 매뉴얼의 지시에 따라 반응액 10μL 에 1μg의 total RNA, 1μL 5× gDNA Erager, 2μL RNase-Free DNase을 혼합하여 42℃에서 2분 처리하였다. gDNA를 제거한 total RNA를 이용하여 매뉴얼의 지시에 따라 20μL의 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 50배 희석하여 RT-qPCR에 이용하였 다. 기존에 보고된 서열을 기반으로 프라이머를 다자인하여 분석 에 이용하였다(Kim et al. 2016). 최종 반응액 20μL에 1× SYBR premix EX taq Ⅱ(TaKaRa, Japan), 0.25μM forward primer(5′ -CTGACATACCAAACCTCCCATAC-3′), 0.25μM reverse primer(5′ -TCACATGATTCCACAGCTTCTC-3′), 3μL의 희석 cDNA를 혼합하 여 준비한 후 CFX96(BioRad, USA)을 이용하여 RT-qPCR을 수행하 였다. 반응조건은 95℃에서 30초간 initial denaturation을 수행 후, 95℃ 5초, 58℃ 30초 과정을 45반복하였다. 그 후 95℃에서 30초 premelting과 65℃에서 95℃까지 5초마다 0.5℃씩 온도를 높여가며 melting curve 분석을 수행하였다. Housekeeping 유전자 ACTIN의 Ct값으로 normalization하였으며, 상대정량값의 계산은 ΔΔCt법을 이용하였고, 3반복의 상대정량값으로 평균과 표준오차 를 계산하였다.

결과 및 고찰

ClF3 ′5 ′H 유전자 도입 페튜니아 식물체 획득 및 도입 유전자 분석

ClF3 ′5 ′H 유전자의 기능을 확인하고자 아그로박테리움 공 동배양을 이용하여 페튜니아 ‘Dream’s Red’잎 절편체 110개 에 도입한 결과, 110개의 잎 절편체 중 5개(4.5%)에서 51개의 재분화 신초를 획득하여 발근배지에서 발근시켰다(Table 1, Fig. 2). 선발배지에서 선발된 51개체 대상으로 도입 목표유전 자와 선발유전자인 ClF3 ′5 ′H와 NPTⅡ 유전자의 도입여부를 확인하기 위하여 PCR 분석을 실시한 결과, 51개체 중 49개체 가 목표유전자와 선발유전자가 도입되었음을 확인하였다. 49 개체 중 22개체를 대상으로 도입유전자 copy 수를 확인하고 자 서던분석을 실시한 결과 22개체 모두 1~3개의 ClF3 ′5 ′H 유전자가 도입되었음을 확인하였다(Table 2, Fig. 3). 또한, 도입유전자의 정상적인 발현을 확인하기 위하여 노던분석을 실시한 결과, ClF3 ′5 ′H 유전자의 정상적인 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

ClF3 '5 'H 유전자 도입 확인 페튜니아의 식물체 특성 및 도입유전자 발현

PCR 및 서던분석에 의해 ClF3 ′5 ′H 유전자의 도입이 확인 되고 노던분석에 의해 도입유전자의 정상적인 발현이 확인된 ClF3 ′5 ′H 도입 Dream’s Red 품종유래 형질전환체들의 표현 형적 특성을 확인하고자 순화를 거쳐 온실에서 생육시킨 후 비형질전환체와 꽃 특성을 비교 조사한 결과, 49개체 중 ClF3′ 5′H-1-07-1 등 7개체가 비형질전환체에 비하여 꽃잎 주요색, 화관 내부색, 및 암술기관 색 및 꽃잎 가장자리 모양이 크게 변형되었다. 꽃잎 주요색의 경우, 비형질전환체는 RHS color chart상 red group의 적색인 45B이었으나 ClF3′5′H-1-07-1 등 3개체는 비형질전환체 보다 진적색인 46A 이었다. 화관 내부 색의 경우, 비형질전환체는 RHS color chart상 red-pupple group의 적보라색 59B이었으나, ClF3′5′H-1-07-2 등 6개체는 진적보라색 59A 이었고, ClF3′5′H-2-08-7은 purple group의 N77이었다(Table 3, Fig. 5). 이는 Shimada et al.(2001)이 F3′ 5′H 유전자가 청색이나 보라색 발현에 필요한 유전자임을 밝 힌 연구에서 페튜니아 Falcon Pink Vein와 Falcon Rose 유래 형질전환체 No.13이나 No.102의 화관 내부색의 색이 진보라 색으로 변한 양상과 같은 결과이다. 암술머리색의 경우, 비 형질전환체는 RHS color chart상 yellow- green group의 연 한 연두색인 145C이었으나 ClF3′5′H-2-08-1 등 7개체 모두 purple group의 N77C, 77D, N77A, 79A 및 79C이었다. 암술 대색도 비형질환체는 RHS color chart상 greyed-yellow group 의 162C이었으나, ClF3′5′H-2-08-10과 ClF3′5′H-2-08-1은 yellow-white group의 158A이었고, ClF3′5′H-6-5 등 5개체는 greyed-yellow group의 161B, 161C 및 161D이었다. 꽃잎 가 장자리 모양의 경우, 비형질전환체는 물결이 거의 없거나 매 우 약하였던 반면, 비형질전환체보다는 물결모양이었으나 약 했던 ClF3′5′H-2-08-7를 제외하고는 중간정도 이상의 물결모양 을 나타냈고, ClF3′5′H-2-08-11과 ClF3′5′H-6-5 2개체는 매우 강한 물결모양을 나타냈다(Table 3, Fig. 5). Shimada et al.(1999, 2001)의 연구에서도 F3′5′H 유전자를 페튜니아 Falcon Pink Vein 품종에 도입하여 획득한 형질전환체 No.13 의 꽃 잎 가장가리가 물결모양이나 화관이 쪼그라들었다는 보 고와 일치하는 결과이다. 이와 같이 본 연구 결과가 Shimada et al.(1999, 2001)의 연구 보고와 같은 결과가 도출된 것으로 볼 때 ClF3 ′5 ′H 유전자가 도입된 페튜니아 형질전환체에서 나타난 꽃잎 가장자리가 물결모양으로 변한 것이 도입 유전자 의 영향은 분명한 것으로 판단된다. 그러나 ClF3 ′5 ′H 유전자 의 도입에 의해 다른 유전자가 영향을 받아 특성의 변화가 일 어날 수도 있으므로 추후 연구가 더 필요할 것으로 생각된다. ClF3′5′H-1-07-1 등 7개체의 변형된 꽃 특성이 도입 유전자인 ClF3'5'H의 발현에 의한 것인지를 확인하고자 꽃잎, 화관, 암 술기관의 RT-qPCR 분석을 실시한 결과, 형질전환체 7개체 모 두 비형질전환체보다 꽃잎, 화관, 암술기관에서 ClF3 ′5 ′H 유 전자의 발현이 훨씬 높음을 확인할 수 있었다. ClF3'5'H 유전 자의 평균 발현값에 있어서는 화관이 꽃잎과 암술기관보다 약 3배정도 높았다. 특히 암술머리색의 변형이 두드러졌던 ClF3′ 5′H-1-07-1과 ClF3′5′H-1-07-2가 ClF3′5′H 유전자의 발현값이 상당히 높게 나타났다(Fig. 6).

Tanaka et al.(2010)이 블루 카네이션과 장미의 델피니딘 축적에 있어서 F3′5′H 유전자가 매우 중요한 역할을 한다고 정리 보고한 바와 같이 본 연구에서도 클레마티스에서 분리한 ClF3′5′H는 화색을 블루로 변형시키는 것이 확인되었으므로 향후 청색발현 화훼 형질전환체 개발 연구에 이용할 수 있을 것으로 기대한다. 그러나 Noda et al.(2017)이 카네이션이나 장미보다 더 진정한 청색 변형 형질전환체 개발을 위해서는 F3′5′H 유전자 이외 중요한 역할을 한다고 보고한 글루코실화 유전자에 대한 추가적인 동정 연구가 필요할 것이다.

초 록

화색변형 화훼 형질전환체 개발을 위한 유전자를 개발하고자 클레마티스로부터 청색소 발현 유전자를 동정하여 ClF3 ′5 ′H로 명명하였다. 아그로박테리움 공동배양 경유 형질전환기술을 이용 하여 페튜니아 Dream’s Red 품종에 ClF3 ′5 ′H 유전자를 도입하였 고, 선발배지에서 재분화한 식물체 51개체를 PCR분석하여 49개체로 ClF3 ′5 ′H 유전자의 도입을 확인하였다. 또한 22개체의 서던분석 을 통해 ClF3 ′5 ′H 유전자가 1~3개 copy가 도입되었음을 확인하였 고, 노던분석을 통해 형질전환체에서의 ClF3 ′5 ′H 유전자의 정상 적인 발현을 확인하였다. ClF3 ′5 ′H 유전자가 도입된 페튜니아 형질전환 식물체 7개체가 개화할 때 ClF3 ′5 ′H 유전자가 도입된 페튜니아아의 꽃잎 주요색이 적색에서 진적색으로, 화관 내부색이 적보라색에서 진적보라색 또는 자주색 계역로, 암술머리색이 연두색에서 자주색 계열로, 꽃잎 가장자리 모양이 물결모양으로 변형되는 것을 확인하였다. 또한 실시간 정량 유전자 분석을 통해 형질전환 7개체에서의 표현형적 변화가 ClF3 ′5 ′H 유전자의 발현에 의한 것임을 입증하였다.

추가 주요어: 화관 내부색, 꽃잎 주요색, Petunia hybrida, RT-qPCR, 꽃잎 가장자리 모양