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ISSN : 1225-5009(Print)
ISSN : 2287-772X(Online)
Flower Research Journal Vol.25 No.4 pp.232-239
DOI : https://doi.org/10.11623/frj.2017.25.4.07

Development of Mass Propagation System via Rhizome Culture in Elite Breeding Line C269 of Alstroemeria

Sung-Wha Park1, Sang-Hyun Lee1,2, Jong Bo Kim3, Hyo Jin Jung1,4, Seong-Gon Wi2, Tae-Ho Han1,2,4*
1Department of Horticulture, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea
2Asian Pear Research Institute, Chonnam National University, Gwangju 500-757, Korea
3Department of Biotechnology, Konkuk University, Chungju 27478, Korea
4GARDENPLANT(Co.), Gwangju 61186, Korea

† Co-first author.

Corresponding author: Tae-Ho Han +82-62-530-2066wageningen@hanmail.net
20170821 20171009 20171019

Abstract

An in vitro production system of Alstroemeria C269 was investigated to provide virus-free stock of domestically selected for cultivar registration. Alstroemeria C269 was bred in the ornamental plant science laboratory at Chonnam National University and primarily cultured on MS basal medium. Rhizome tips for rhizome mass propagation were cultured on MS medium supplemented with different concentrations of 6-benzylaminoputin (BAP) and kinetin (KIN ). E xplants from t he m edium supplemented w ith KIN had numerous shoots and densely grew. Therefore, this approachwas unsuitable for in vitro rhizome mass propagation due to difficult rhizome splitting. However, explants cultured in medium supplemented with BAP at a concentration below 0.2 mg L-1 were appropriate for in vitro rhizome split propagation. The greatest number of roots was obtained from the medium supplemented with NAA at 0.25 mg L-1. However, abnormal roots were observed in the medium supplemented with NAA. More rootlets and root hair were induced in MS medium than in MS medium supplemented with NAA. In acclimation, plantlets survived more in MS medium t han in M S medium s upplemented with N AA. Besides, the shoot induction and aboveground growth were better in MS medium than in MS medium supplemented with NAA. Based on these results, the efficient rhizome mass propagation method of Alstroemeria hybrid C269 is 8 weeks of culture in MS medium supplemented with 0.2 mg L-1 BAP, followed by culture in MS medium for around 5 weeks for rooting before acclimation.


근경 배양을 이용한 알스트로메리아 우량 육종계통 C269의 대량증식 체계 개발

박 성화1, 이 상현1,2, 김 종보3, 정 효진1,4, 위 승곤2, 한 태호1,2,4*
1전남대학교 원예학과
2전남대학교 동양배연구소
3건국대학교 생명공학과
4(주)가든플란트

초록


    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs
    116092-3

    서 언

    알스트로메리아(Alstroemeria)는 알스트로메리아과(Alstroe meriaceae)에 속하는 단자엽 식물로, Peruvian lily 또는 Inca lily라고도 한다(Bridgen 1997). 알스트로메리아 종의 분포는 칠레와 브라질을 중심으로 100여종이 넘는 자생종이 있다(Ak er and Healy 1990). 네덜란드에서 개발된 알스트로메리아 신 품종들은 알스트로메리아 원종을 이용하여 안정적인 잡종 세 대를 수년에 걸쳐 만들어 현재 시판 되고 있다.

    우리나라는 유럽식 화훼장식의 열풍으로 알스트로메리아가 도입되어 수요가 급증하였다. 알스트로메리아는 2000년대에 들어서 재배되기 시작하여 약 2ha면적을 시작으로 소비자들 의 관심과 더불어 고소득 작물로써 점차 재배 면적을 넓혀 2013년 기준으로 재배면적이 12ha에 이르고 있다(Park et al. 2015). 그러나 국내 재배 품종은 모두 수입 품종으로 고가의 로열티를 지불하며 경작되고 있는 실정이다.

    세계적으로 절화용 알스트로메리아는 종간 또는 품종과 교 잡으로 품종이 개발되고 있으며, 수분 후 장벽이 존재하는 알 스트로메리아 품종의 육성 정보와 최적화 된 기내 대량 번식 기술정보는 회사의 기밀에 해당한다(Dubouzet et al. 1998). 네덜란드나 일본에서는 개량된 신품종 번식을 위해서 조직배 양을 이용한 대량번식기술이 확립되어 사용하고 있지만, 우리 나라와 같이 알스트로메리아를 도입하여 처음 육종을 시도하 는 경우, 지형과 기후에 맞고 소비자의 선호도에 맞는 새로운 품종 육성과 기내 대량 번식 기술 개발에 어려움이 있다. 본 연구팀은 품종과 교잡 시, 수분 후 장벽을 타파하여 알스트로 메리아 실생을 만들어 내는 수준까지 국내 기술력을 확보한 상황이며, 현재 국립 종자원 등록된 22품종의 알스트로메리아 중 3개의 품종이 본 연구팀에서 개발한 품종이다(KSVS 2016).

    본 연구에서는 국내 품종 출원 예정인 알스트로메리아 유망 교잡 계통 C269의 생장점 배양을 기본으로 기내 근경 생장점 의 번식을 위한 호르몬 배지 조건 및 기내 발근 배지의 조건을 구명하고자 하였다. C269의 기내 번식 체계 조건을 구명은, 국 내 육성 알스트로메리아 번식체계 시스템화를 통해 국산 알스 트로메리아 묘의 안정적 보급에 기여할 것으로 기대한다.

    재료 및 방법

    식물재료 및 배양체 준비

    전남대학교 화훼원예학 연구실에서 품종출원 예정인 알스 트로메리아 교잡 계통 C269를 식물 재료로 사용하였다. C269 화색은 흰색(RHS color chart: White group NN155D)이며, 꽃 크기와 초장이 수입 품종과 비교하여 월등히 크고 줄기 또한 굵어 절화로서 가치가 높다고 판단되는 우량 육종 계통이다 (Fig. 1).

    C269의 근경을 살균 후 수세하여 MS배지(Murashige and Skoog 1962) salts, 3% sucrose, 0.25% gelite, 6-Benzylaminopurin 1.0mg·L-1, pH 5.8±0.1에 치상하여 초대배양 하였다. 배양체는 기온 19±1℃인 배양실에서 명기 16시간과 암기 8시간의 조건 하에서 배양하였다. 배양실의 광원으로는 형광램프(FHF32SS-EX-D, NAMYUNG LIGHTING Co., Korea)를 이용하였다. 초대배양 이후 4주에 한번 계대배양을 실시하여 근경 증식을 통해 실험을 위한 C269의 근경 생장점을 준비하였다.

    알스트로메리아 근경 증식 최적 배지 구명을 위한 호르몬 실험

    C269의 근경을 증식하기 위한 최적배지조건을 구명하기 위 하여 아래와 같이 6-Benzylaminopurin(BAP)와 Kinetin(KIN) 농도별로 준비된 배지에 근경의 눈을 적출해 배지에 치상하였 다. 무처리구는 MS배지를 사용하였다. BAP 처리구는 0.1, 0.2, 0.5, 1.0mg·L-1를 농도별로 MS배지에 첨가하였다. KIN 처리구는 0.1, 0.2, 0.5, 1.0mg·L-1를 농도별로 첨가하여 총 9 처리구를 3반복으로 실험하였다. 각 배지는 Incu tissue(72 × 72 × 100, SPL)에 약 90mL 분주하여 준비하였다.

    배양체는 Incu tissue(72 × 72 × 100, SPL)당 각 4개의 근경 눈을 치상하여 처리구 당 총 20개 치상하여, 4주에 한번씩 계 대배양 하였다.

    조사 항목으로는 매주 줄기 수, 뿌리 생성 수 그리고 뿌리 부위를 제거한 후 생체중을 조사하였다. 2주 간격으로는 엽 수, 줄기 길이를 추가로 조사하였다.

    알스트로메리아 최적 발근 배지 구명

    C269 근경의 최적 발근 배지 구명을 위하여 근경 증식 배 지에서 9주간 증식된 배양체에서 근경의 눈(끝 눈 및 옆 눈)과 신초 1개를 함께 적출해 발근 배지에 치상하였다. 발근 배지 는 1-Naphthaleneacetic acid(NAA)를 농도 처리하였다. 무처 리구는 MS배지였으며, NAA는 0.25, 0.5, 0.75, 1.0mg·L-1 농 도별로 첨가하여 총 5개 처리구를 2반복하였다. 조사 항목으 로는 9주 뒤 뿌리 수, 최대 뿌리 두께, 최장 뿌리 길이, 신초 수, 최대 신초 두께, 최장 신초 길이를 조사하였다.

    NAA 발근배지에서 자란 뿌리 단면 관찰

    뿌리 단면 사진은 뿌리 성숙 부위 조직을 채취하여 formalin-acetic acid-alcohol(FAA) 고정액에 넣어 4℃에서 48 시간동안 고정한 후 50, 70, 90, 95, 100% 에탄올로 탈수, 자 일렌으로 치환, 파라핀 침투과정을 거쳐 파라핀 블럭을 제작 하였다. 회전식 마이크로톰(RM2145, LEICA, Germany)을 사 용하여 제작된 10μm 두께의 연속절편을 poly-L lysine 도포된 슬라이드 글라스 위에 부착시켜 실온에서 건조하였다. 이후 자일렌을 이용하여 파라핀을 제거한 후, 에탄올로 재수화 시 켜 1% safranin으로 염색하고 에탄올로 탈수한 후 Canada balsam으로 봉입하여 광학 현미경(BX51, Olympus, Japan)으 로 관찰하였다.

    식물체 순화

    식물체의 순화를 위해 배양체는 흐르는 물에 세척 후, 멸균 된 상토(Horticultural Soil Mix No. 2/Light Weight, SungWha Co., Korea)가 들어 있는 플라스틱 화분(9 × 9 × 10cm)에 이 식하였다. 광량과 습도를 조절하기 위하여 각 화분을 Incu tissue(72 × 72 × 100cm, SPL)로 덮어주었으며, 2주 후부터 점 차적으로 덮개를 벗겨 주었다. 순화체는 기온 23 ~ 25℃에서 명기 18h·d-1와 암기 4h·d-1의 조건하의 배양실에서 순화 되 었다. 약 1달 이후부터 온실로 이동 시켜준 후, 배지별 활착률 을 육안 조사하였다.

    통 계

    통계 분석은 SPSS software(IBM SPSS statistics 23)를 이용 하여 ANOVA(Analysis of variance)분석을 실시하였다. 처리 구간의 유의성 검정은 DMRT(Duncan’s Multiple Range Test) 5% 수준에서 실시하였다.

    결과 및 고찰

    알스트로메리아 근경 증식 최적 배지 구명을 위한 호르몬 실험

    알스트로메리아에서는 근경 및 신초 유도를 위해 BAP를 사 용되었다(Khaleghi et al. 2008; Pedraza-Santos et al. 2006). Nasri et al.(2013)는 BAP 처리 농도가 높아질수록 신초와 눈 의 수가 많아진다고 보고한 바 있다. 하지만 본 실험에서는 근경 신초 발생 수는 무처리구와 BAP 처리구간에 증가하는 경향치는 있었으나 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Table 1). 반면 KIN처리구 같은 경우 무처리구 보다 대체적으로 많 은 수의 신초가 발생됨을 확인할 수 있었다. 하지만 KIN 처 리구의 경우 신초 발생량은 증가하였으나 조밀하게 생장하여 번식을 위한 분리가 용이하지 않았다(Fig. 2). 따라서 BAP 0.2mg·L-1 이하 농도 배지에서 키운 근경을 분리하여 증식시 키는 것이 효율적인 작업을 위해서 유리할 것으로 사료된다.

    신초 길이는 무처리구에 비해 BAP 처리 시 짧아지는 경향 을 확인하였으며(Table 1), 이와 같은 결과는 Khaleghi et al.(2008)의 실험 결과에서와 마찬가지로 BAP처리 농도가 높 아짐에 따라 줄기 길이가 짧아지는 결과와 같았다. 반면 KIN 처리구의 경우 무처리구와 비교하여 통계적으로 유의한 처리 구는 없어, BAP와 함께 같은 사이토카이닌류 호르몬이지만 신초길이에는 영향력이 적은 것으로 판단되었다. 엽수는 모든 처리구에서 유의한 차이가 없었다. Nasri et al.(2013)는 BAP 단용 처리구에서 엽수가 가장 적었다고 보고 한바 있어, 본 C269 계통의 특성일 가능성을 고려해 볼 수 있다. 뿌리 발생 량은 무처리구와 KIN 0.1mg·L-1, KIN 0.2mg·L-1 처리구에 서 가장 많았으며, BAP 1.0mg·L-1에서 발생량이 가장 적었 다. 이는 Pedraza-Santos et al.(2006)과 마찬가지로 KIN처리 는 BAP처리에 비해 뿌리 생장이 저해 되지 않음을 확인할 수 있었다. 생체중은 엽수와 같이 모든 처리구에서 유의한 차이 가 없었다.

    BAP처리는 근경의 성장이 주로 이루어져, 근경이 수평적으 로 생장해 나가고 근경이 눈에 쉽게 띄어 근경 분리에 용이한 형태로 보였으나, KIN처리는 근경의 성장을 육안으로 확인할 수 없을 정도로 신초가 조밀하게 발생되고 근경이 BAP처리에 의해 발생되어진 것보다 작은 크기로 관찰되어 근경 분리를 하는데 어려움이 있을 것으로 생각되어져 근경 증식의 목적에 알맞지 않은 것으로 생각되어진다. 생체중의 차이는 BAP 0.5mg·L-1농도 이상부터는 수(pith)층의 과다한 비대로 인한 결과로 생각되며, 줄기와 뿌리는 기내 번식 시 제거되어지는 부분이므로 BAP 0.2mg·L-1농도 이하에서 근경을 증식 하는 것이 적합 할 것으로 생각되어 진다.

    KIN처리는 신초 발생 후 지상부 생장이 활발하여, Lin et al.(2000a)이 제안한 엽 배양을 통한 캘러스 유도로 식물체를 번식하는 시스템을 적용하여, 근경 및 엽 배양을 동시에 진행 하여 더 많은 식물체를 대량 증식하는데 이용할 수 있을 것으 로 기대된다. Lin et al.(2000b)은 근경과 엽 배양을 동시 진행 하여 번식하는 체계를 비교하여 확립하였다. 향후 C269에서 도 KIN처리를 통한 엽 배양 효율을 확인 할 필요성이 있다고 사료된다.

    알스트로메리아 최적 발근 배지 실험

    뿌리 생성수은 무처리구 포함 호르몬 농도가 높아질수록 더 많이 발생되었고, 반대로 2cm 이상의 뿌리 발생량은 호르몬 농도가 높아질수록 줄어들었다. 2cm 이상 뿌리의 발생량은 NAA 0.25mg·L-1처리에서 가장 많이 발생되었다(Table 2). 뿌리 두께 같은 경우, NAA 처리구가 무처리구에 비해 현저히 두꺼운 뿌리가 발생되었다(Fig. 3). 뿌리 길이는 호르몬 처리 구에 비해 무처리구가 월등히 길었으며, 가장 긴 뿌리는 무처 리구에서 확인되었다. 또, 호르몬 처리 시 농도가 진해 질수 록, 발생되는 뿌리 길이가 짧아지는 경향을 확인하였다.

    Khaleghi et al.(2008)는 NAA의 유무는 뿌리 길이에 큰 영 향이 없다고 하였으나, 본 실험에서는 뿌리길이 또한 농도가 고농도일수록 짧아질 뿐만 아니라 배지에 NAA가 존재하지 않 는 것과 존재한 것에 대한 차이를 확인할 수 있었다. 또한, 순 화에 적합한 뿌리 발생량은 NAA 0.25mg·L-1 이상의 농도에 서는 기대하기 어려운 것으로 사료된다.

    NAA가 뿌리 형성에 효과적이라는 타 연구에 비해(Gabryszewska and Hempel 1985; Kristiansen et al. 1999; Pedersen et al. 1996; Pierik et al. 1988). 본 실험에서는 효과적이지 않았는데, Hakkaart and Versluijs(1988)은 호르몬 처리 없이 뿌리 발근이 가능하다고 보고 한바 있으며, Pedraza-Santos et al.(2006)은 무처리가 NAA 첨가 보다 뿌리가 잘 발생이 되었다고 보고하였고, 이와 마찬가지 로 본 실험에서도 무처리구에서 정상적인 뿌리를 순화에 부족하지 않았다.

    신초의 수는 처리구간 유의한 차이가 없었다(Table 2). 신 초 두께의 경우, 0.25mg·L-1 농도에서 가장 두꺼웠으나, 무처 리구와 차이가 크지 않았다. 신초 길이는 NAA 0.5mg·L-1에 서 가장 짧은 경향을 보였다. 처리구 간 생육 차이를 확인할 수 있었다(Fig. 3). 호르몬 처리 시 무처리구에 비해 여러 뿌 리가 붙어 자라는 듯한 비정상적인 뿌리를 확인하고, 비정상 적인 뿌리 비대가 이루어지며, 호르몬 처리 농도가 높아질수 록 뿌리 길이는 짧아졌고, 잔뿌리 발생량도 적었다. 호르몬 처 리구의 뿌리 비대는 현미경 관찰을 통해 기본 조직 수(pith)층 의 비대로 인한 것임이 확인 되었다(Fig. 4, 5). 무처리구가 호 르몬 처리구에 비해 뿌리가 월등히 길며, 뿌리에 따른 세근과 뿌리털이 더 많은 것을 확인하였다. 이러한 결과로 보아 NAA 호르몬 처리를 하지 않고 발근을 유도하는 것이 경제적이고 효율적일 것으로 사료된다.

    순 화

    무처리구 포함 호르몬 처리구 모두 각 호르몬 농도별 발근 된 뿌리의 활착률을 확인하기 위해 발근 배지별 순화를 시켰 다(data not shown). 육안 조사결과는 기외 상태에서 신초의 발생을 순화 성공으로 처리하고 지상부의 상태로 활착률을 판 단하였다. 무처리구에서 발근된 식물체들은 뿌리 활착이 대부 분 성공하여 생존하였지만 호르몬 처리를 통해 발근된 식물체 들은 대부분이 뿌리 활착에 실패하여 죽었다. 기외 적응 후 지 상부 생육 상태 또한 무처리구에서 초반 생육이 왕성하였다.

    초 록

    국내 출원 예정인 알스트로메리아 유망 교잡 계통 C269의 기내번식체계 조건 구명을 통해 국산묘의 안정적인 보급에 기 여하고자 본 연구를 수행하였다. 생장점을 MS배지에 치상하 여 초대배양 후, 준비된 근경 생장점은 근경 증식을 위해 6-Benzylaminopurin(BAP)와 Kinetin(KIN)처리를 하였다. KIN 처리구의 경우, 신초 발생량이 많고 조밀하게 생장 했다. 이는 근경 증식을 위한 근경 분리가 힘들어 근경 증식에는 적합하 지 않았다. BAP 처리구의 경우 0.2mg·L-1이하의 농도 배지 에서 키운 근경을 분리하여 증식 시키는 것이 적합할 것으로 생각되었다. 뿌리 발근 배지는 1-Naphthaleneacetic acid(NAA) 0.25mg·L-1첨가 배지에서 가장 많은 뿌리가 발생되었다. 하 지만, NAA 호르몬 처리에 의한 비정상적인 뿌리 비대가 발생 되었다. 반대로 무처리구에서는 정상적인 뿌리, 세근 및 뿌리 털 발생이 더 좋았다. 순화 과정 중에는 호르몬 처리구 보다 무처리구가 많은 생존률을 보였을 뿐만 아니라 신초 발생 및 지상부 생육도 무처리구에서 왕성하였다. 결론적으로 알스트 로메리아 교잡 계통 C269는 BAP 0.2mg·L-1처리에서 근경을 증식한 후 MS 배지로 옮겨 치상 후 발근을 유도하여 순화를 시키는 것이 효과적인 증식체계로 판단되었다.

    추가 주요어: 순화, 기내, Kinetin, 1-Naphthaleneacetic acid, 6-Benzylaminopurin

    사 사

    본 연구는 농림축산식품부 농생명산업기술개발사업(116092-3) 에 의해 이루어진 것임.

    Figure

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    Alstroemeria C269, A. The front of flower; B. The side of flower; C. The upper side of flowers.

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    Effects of 6- benzylaminopurine (BAP) and Kinetin (KIN) on in vitro growth of Alstroemeria C269 in the 12th week, A. Explants growth on MS medium; B. Explants growth on medium with BAP 0.1 mg·L ⁻1¹; C. Explants growth on medium with BAP 0.2 mg·L ⁻1; D. Explants growth on medium with BAP 0.5 mg·L ⁻1; E. Explants growth on medium with BAP 1.0 mg·L ⁻1; F. Explants growth on medium with KIN 0.1 mg·L ⁻1; G. Explants growth on medium with KIN 0.2 mg·L ⁻1; H. Explants growth on medium with KIN 0.5 mg·L ⁻1; I. E xpla nts growth on m edium with K IN 1 .0 m g·L ⁻1.

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    Effects of NAA on roots growth of Alstroemeria C269 in the 9th week, A. Explants growth on MS medium; B. Explants growth on medium with NAA 0.25 mg·L ⁻1; C. Explants growth on medium with NAA 0.5 mg·L ⁻1; D. Explants growth on medium with NAA 0.75 mg·L ⁻1; E. Explants growth on medium with NAA 1.0 mg·L ⁻1.

    FRJ-25-232_F4.gif

    Cross section for the effect of NAA on the growth of roots in Alstroemeria C269 roots in the 7th week for the observation of NAA effects; Co. Cortex; En. endodermis; Ep. endodermis; Me. metaxylem; Pe. pericycle; Ph. phloem; Pi. pith; Pr. protoxylem; A. Cross section of in vitro Alstroemeria C269 root from MS medium; B. Cross section of in vitro Alstroemeria C269 root from MS medium supplement with NAA 0.25 mg·L ⁻1.

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    Longitudinal section for the effect of NAA on the growth of roots in Alstroemeria C269 roots in the 7th week for the observation of NAA effects; AM. Apical meristem; RC. Root cap; Co. Cortex; En. Endodermis; Ep. Endodermis; Pe. Pericycle; Pi. Pith.

    Table

    Effects of hormones on the growth of rhizomes from Alstroemeria C269 at 8 weeks after the culture.

    zMS medium used as basal medium and solidified with 0.25 g·L-1 g elite (pH 5.8 ± 0 .1). M S. M S medium; B0.1. MS m edium with BAP 0.1 mg·L-1; B0.2. MS medium with BAP 0.2 mg·L-1; B0.5. MS medium with BAP 0.5 mg·L-1; B1.0. MS medium with BAP 1.0 mg·L-1; K0.1. MS medium with KIN 0.1 mg·L-1; K0.2. MS medium with KIN 0.2 mg·L-1; K0.5. MS medium with KIN 0.5 mg·L-1; K1.0. MS medium with KIN 1.0 mg·L-1.
    yThe values are the mean ± SE (n = 59).
    xMeans in a column followed by the same letter are not significantly different according to Duncan’s test (P = 5%).

    Effect of hormone concentration on the number of roots from Alstroemeria C269 rhizome at 9 weeks after the culture.

    zMS medium used as basal medium and solidified with 0.25 g·L-1 g elite (pH 5.8 ± 0.1); M S. M S medium; N0.25. M S medium w ith NAA 0.25 mg·L ⁻1; N0.5. MS medium with NAA 0.5 mg·L ⁻1; N0.75. MS medium with NAA 0.75 mg·L ⁻1; N1.0. MS medium with NAA 1.00 mg·L ⁻1.
    yThe values are the mean ± SE (n = 40).

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