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섬쥐똥나무는 물푸레나무과 쥐똥나무속 식물로 쥐똥나무, 제 주광나무, 광나무, 상동입쥐똥나무, 둥근잎광나무, 털쥐똥나무, 버들쥐똥나무 등 13종 이상의 식물이 같은 속에 포함되어있다 (Kim et al. 2012). 이 중 섬쥐똥나무는 울릉도에만 자생하는 특산식물로 잎은 마주나기하며 거꿀달걀모양, 도란상 타원형, 좁은 타원형 또는 피침형으로 길이는 1~6cm, 폭은 0.7~3cm로 톱니가 없고 뒷면 맥 위에 잔털이 있다(NKISBS 2016). 꽃은 백색으로 5월에 복총화서로 피며, 과실은 난상 원령이며 7~8cm 크기로 10월에 검게 익는다(Lee et al. 1999).
섬쥐똥나무와 같은 속인 쥐똥나무는 국내에서 주로 조경소재 로 생울타리에 이용되고 있고, 주로 쥐똥나무와 왕쥐똥나무가 도입되어 관상용으로 재배되고 있다(Kim and Kang 1999). 이러 한 쥐똥나무와 왕쥐똥나무를 대체할 특산식물로 섬쥐똥나무를 들 수 있으며, 쥐똥나무보다 화서가 크고 꽃잎이 두꺼워서 관상 적 가치가 높고, 꽃의 향이 진한 특징을 가지고 있다(NKISBS 2016). 따라서 현재 관상용으로 사용되고 있는 쥐똥나무와 왕쥐 똥나무를 대체, 보완할 수 있는 소재로 기대하고 있다.
식물의 대량번식 방법 중 실생번식법의 경우 단시간에 다량 의 개체를 확보할 수 있고 많은 노동력을 필요로 하지 않는다 는 장점이 있다. 하지만, 식물이 불리한 환경조건에서 생존하 기 위하여 발아를 억제하는 수단을 종자휴면이라고 하는데, 재 배의 관점에서 종자휴면을 타파해야 하는 어려움이 있다(Lee et al. 2012). 또한 종자가 발아하고 유묘가 출현하는 시점은 종에 따라 다르며, 이는 식물의 생활환, 서식지의 환경조건 및 지리적 분포에 따라 차이가 나기 때문에 다양한 유형의 종자휴 면이 존재한다(Lee et al. 2014). 이러한 종자의 휴면은 수많은 연구자들에 의하여 분류가 되어왔는데, Lang(1987)의 연구에 따르면 종자 발아의 원인에 따라 환경휴면(eco-dormancy), 외재 휴면(para-dormancy), 내재휴면(endo-dormancy)의 세 가지로 분류를 하였으며, Baskin and Baskin(2004)은 생리적, 형태학 적 요인을 종합적으로 고려하여, 종자 내・외부의 발아저해물질 로 인해 발아가 억제되는 생리적 휴면(physiological dormancy, PD), 미숙배를 지닌 형태적 휴면(morphological dormancy, MD), 생리적 휴면과 형태적 휴면이 복합적으로 작용하는 형태생리 적 휴면(morphophysiological dormancy, MPD), 종자의 수분 흡수가 억제되는 물리적 휴면(physical dormancy, PY), 물리적 휴면과 생리적 휴면의 조합 휴면(combinational dormancy, PY+PD)과 같이 크게 다섯 가지로 분류한 후 각각의 유형을 휴면의 깊이에 따라 세분화하였다(Lee et al. 2012).
쥐똥나무속 식물에 대하여 Baskin and Baskin(2014) 은 Bezdeckova et al.(2009)의 연구를 인용하여 Ligustrum obtusifolium과 Ligustrum vulare의 경우 생리적 휴면(PD)을 가지고 있다고 발표하였다. Lee et al.(2015)에 따르면 생리적 휴면의 경우 저온층적처리, 후숙처리, 또는 GA3(gibberellic acid)처리로 휴면이 타파 된다. 또한 생리적 휴면은 깊이에 따 라 deep PD, intermediate PD, non-deep PD로 세분화 하여 구분하고 있다(Nikolaeva 1977). 세 가지 세분화된 생리적 휴 면 유형의 특징은 deep PD는 휴면타파를 위하여 GA3를 처리 할 경우 효과가 없으며, 3~4개월의 저온층적처리 또는 고온층 적처리를 할 경우 휴면이 타파된다(Baskin and Baskin 2004). Intermediate PD는 종에 따라서 GA3처리로 인해 휴면이 타파 되며, 2~3개월의 저온층적처리를 통하여 휴면이 타파되는데, 후숙처리를 통해서 기간을 단축시킬 수 있다(Baskin and Baskin 2004; Baskin et al. 2005). Non-deep PD는 GA3로 인 하여 휴면이 타파되고, 종에 따라서는 0~10℃의 저온 또는 1 5℃이상의 상대적 고온에서 휴면이 타파된다(Baskin and Baskin 2003a; Baskin and Baskin 2004).
섬쥐똥나무의 안정적인 대량증식방법으로 실생번식법이 효 율적이라 판단되며, 실생번식법 개발을 위한 섬쥐똥나무 종자 의 정확한 휴면유형분류가 필요하다. 본 연구는 섬쥐똥나무 종자의 휴면유형을 확실하게 분류하여 이 후 섬쥐똥나무의 대 량증식을 통한 산업화의 기초 자료로 활용될 것으로 기대한다.
재료 및 방법
식물 재료
본 연구에 사용된 섬쥐똥나무(Ligustrum foliosum Nakai)종 자는 2015년 10월 4일 경기도 양평군 소재의 국립수목원 유용 식물증식센터 부속온실에서 보존되고 있는 모체로부터 채종 하였다. 채종한 종자는 빛이 없고 통풍이 잘되는 곳에서 5일 동안 상온 건조 후 정선하여 2016년 2월 15일 실험에 사용하 기 전까지 냉장(5℃) 보관하였다.
종자의 내・외부 형태 조사
냉장보관중인 종자를 실험실에서 양날면도칼(Stainless blade, Dorco, Seoul, KR)을 이용하여 반으로 자른 후 USB현미경(AM 3111 Dino-Lite premier, AnMo Electronics Co., Taiwan)을 이용 하여 50-60 배율로 촬영하였다. 종자의 발아 전・후 시점의 배의 형태와 크기를 관찰하고 외형을 촬영하였다.
종자 소독 및 배양
실험에 들어가기 전 종자를 1000mg·L-1농도의 소독제 (Benomyl, FarmHannong, Seoul, Korea)에 24시간동안 침지 후 증류수로 3회 이상 세척한 후 두 장의 여과지(Whatman No.1, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 깔고 5mL의 증류수를 공급한 petri dish에 20립 3반복으로 치상하였다. 생장상 내부의 광은 25μmol·m-2·s-1 PPFD의 광도로 16시간 동안 조사하였다. GA3 처리와 저온처리의 경우, 처리가 끝나면 25℃ 항온 생장상 (Multi-Room Incubator, WiseCube, Wonju, Korea)에 배양하면 서 발아율을 조사하였다. 배양기간 동안 미생물이 발생할 경우 1000mg·L-1농도의 소독제(Benomyl, Farmhannong, Seoul, Korea)에 24시간 침지하여 제거하였으며, 여과지가 마르기 전에 증류수를 보충하였다. 발아는 유근이 종피를 뚫고 1mm이상 돌출 하는 것을 기준으로 판단하였고, 1주 간격으로 발아율을 조사하였 다. 조사 시 부패하여 죽은 종자는 즉시 제거하였고, 발아율을 계산할 때는 제외하였다.
수분흡수율
섬쥐똥나무 종자의 불투수성으로 인한 물리적 휴면의 유무 를 알아보기 위하여 수행하였다. 섬쥐똥나무 종자 20립을 두 장의 여과지를 깔고 증류수를 첨가한 petri dish에 3반복으로 상온에서 배양하였다. 종자가 수분을 흡수 하기 전 무게와 배 양 시작 후 3, 6, 9, 12, 24시간이 경과되었을 때의 무게를 측 정하였다. 수분흡수율은 %Ws = [(Wh-Wi)/Wi] x 100의 계산 식을 참고하여 산출하였다(Lee et al. 2015). 위 수식 중 Ws는 수분이 흡수되어 증가된 종자의 상대적 무게비율, Wh는 수분 공급 후 각 시간별 종자 무게, 그리고 Wi는 초기 종자의 무게 를 의미한다.
GA3처리가 발아에 미치는 영향
섬쥐똥나무 종자를 0(대조구), 10, 100, 1000mg·L-1의 GA3 용액에 24시간동안 상온에서 침지하였다. 처리된 종자는 증류 수를 이용하여 3회 이상 세척한 후 종피를 소독한 다음 20립 3반복으로 치상하여 25℃ 생장상에서 배양하였다. 각 처리별 종자는 1주간격으로 발아율을 조사하였다.
저온층적처리가 발아에 미치는 영향
소독이 끝난 종자를 5℃로 유지되는 상장상에 각각 0, 4, 8, 12주 동안 처리한 후 25℃로 옮겨 배양하였다. 실험은 20립 3 반복으로 수행하였고, 1주 간격으로 발아율을 측정하였다.
온도가 발아에 미치는 영향
종자 내부의 배가 신장하고 발아하는 조건을 알아보기 위하 여 6가지 조건의 온도처리에 따른 발아율을 조사하였다 (Baskin and Baskin 2003b; Karin and Susan 2007). 처리 온 도는 4개의 계절을 감안하여 겨울(T1: 5℃), 봄(T2: 15℃), 가 을(T3: 20℃), 여름(T4: 25℃)의 대조구와 겨울에서 봄으로 넘 어가는 온도변화 (T5: 5→15→20℃), 여름에서 가을로 넘어가 는 온도변화 (T6: 25→20→15℃)의 처리구로 나누어 설정하였 다. T1과 T2 처리에서 각 온도는 12, 4, 4주동안 유지 후 변경 하였다(Table 1). 실험 기간 동안 1주 간격으로 발아율을 측정 하였다.
광조건에 따른 발아율 변화
섬쥐똥나무 종자를 1000mg·L-1의 GA3용액에 24시간동안 침지 처리한 후 증류수를 이용하여 3회 이상 세척하였다. 세척 이 끝난 종자는 종피를 소독한 다음 20립 3반복으로 치상하여 15℃ 생장상에서 배양하였다. 이때 광조건은 25μmol·m-2·s-1 PPFD의 광을 16시간 동안 조사하였고, 암조건은 petri dish를 aluminum foil로 싸서 완전히 광을 차단하였다.
통계처리
각 실험의 결과는 SAS 9.4 (SAS Inst. Inc., Cary, NC. USA) 을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 하였고, 처리의 평균간 통 계적인 유의성은 Duncan’s Multiple Range Test (P = 0.05)를 사용하여 비교하였다.
결과 및 고찰
실험에 사용된 섬쥐똥나무의 종자의 종피는 흑갈색을 띄고 있으며, 내부의 배와 배유는 모두 백색이나 배유의 경우 반투 명하여 두 조직의 차이가 육안으로 구분이 되었다(Fig. 1). Fig. 1의 B는 종자가 모체로부터 탈리된 시점의 내부 배, 배유, 떡잎 의 모습이고, C는 또한 종자의 길이는 약 6.5mm, 배의 길이는 5.3mm, 종자에 대한 배의 크기 비율인 E : S ratio(embryo : seed ratio)는 8.3으로 측정되었다(Table 2). 온대지방에 자생 하는 숙근성 식물의 종자 중 많은 수가 모체로부터 탈리되는 시점에 배가 완전히 성숙하지 않은 상태인 것(Martin 1946)으 로 알려져 있고, 이를 미숙배(underdeveloped embryo)라고 부 르며 이러한 종자는 발아를 위해서 배가 성숙할 때까지의 시간 이 필요하다(Baskin and Baskin 1998; Walk et al. 1999). 하지 만 섬쥐똥나무의 경우 종자가 탈리되는 시점으로부터 발아할 때까지 배의 추가적인 신장이 거의 없고, E/S ratio의 증가 없이 성숙한 배로 탈리되기 때문에 미숙배가 아닌 것으로 판단된다. 미숙배를 지닌 경우 적절한 조건에서 30일 이내에 배가 신장되 어 발아하면 이를 형태적 휴면(morphological dormancy, MD) 라고 분류하는데(Baskin and Baskin 1998), 섬쥐똥나무의 경우 미숙배가 아니기 때문에 형태적 휴면은 없는 것으로 판단된다.
섬쥐똥나무 종자의 불투수성을 확인하기 위하여 수분흡수 실험을 수행한 결과 종자의 무게가 3시간 만에 초기무게의 30%이상 증가하였다(Fig. 2). 또한 24시간까지 꾸준히 무게가 증가하여 24시간 경과 후의 무게는 초기 무게의 60%이상 증 가하였다. 종피 혹은 과피로 인하여 수분이 종자 내부로 흡수 되지 않아서 발아가 되지 않는 경우 이를 물리적 휴면으로 분 류하는데(Baskin and Baskin 2000), 24시간 이내에 종자에 흡 수되는 수분의 양이 종자의 건조 무게 대비 20%이상이면 투 수성이 있다고 판단하고, 20%보다 낮을 경우 불투수성이라고 판단한다(Baskin and Baskin 2003b). 따라서 섬쥐똥나무 종자 는 물리적 휴면이 없는 것으로 판단된다. 이를 통해, 섬쥐똥나 무 종자의 경우 물리적 휴면과, 형태적 휴면이 없기 때문에 생 리적 휴면으로 판단하였다. Baskin and Baskin (2003a)의 연 구결과에 따라 생리적 휴면의 세 가지 세분화 유형(deep PD, intermediate PD, non-deep PD) 중 어떤 휴면 유형인지 알아 보기 위하여 GA3처리, 층적처리, 시기별 온도 변화 처리를 수 행하였다.
농도별 GA3를 처리한 결과 1000mg・L-1의 농도에서 6주차 에 발아하기 시작하여 8주차에 5%의 발아율을 보였으나, 14 주까지 추가적인 발아는 없었다(Fig. 3). 단, 대조구와 10mg・ L-1의 농도처리에서는 16주, 100mg・L-1의 농도에서는 15주차 부터 발아가 시작하였고, 100mg・L-1의 농도에서는 약 53%, 10mg・L-1와 1000mg・L-1의 농도에서는 약 40%, 대조구에서는 30%의 최종발아율을 보였다. 위 결과를 통해 GA3로 인하여 휴면이 완전히 타파되었다고 보기는 어렵지만, 최종발아율이 대조구에 비해 모든 처리구에서 증가한 것으로 보아 GA3처리 의 효과가 있다고 판단된다. GA의 경우 ABA와 더불어 종자 의 휴면과 발아를 조절하는 호르몬으로 알려져 있다(Baskin and Baskin 2004). ABA의 경우 발아를 억제하는 물질로 알려 져 있으며, 종자의 성숙과정 중에 종자 내부에서 생성되어 발 아를 억제하지만, GA의 경우 종자가 성숙한 후 발아하기 위 하여 생성이 되며, 세포벽을 가수분해하는 효소의 생성을 촉 진시켜 배유를 분해하여 발아를 촉진한다고 알려져 있다 (Baskin and Baskin 2004). 이러한 연구결과는 Arabidopsis (Debeaujon and Koornneef 2000), potato(Alvarado et al. 2000), Nicotiana plumbaginifolia(Grappin et al. 2000; Jullien et al. 2000) 등의 발아 관련 연구에서도 찾아볼 수 있으며, 생 리적 휴면을 가지고 있는 종자에서는 일반적으로 일어나는 작 용이다(Baskin and Baskin 2004).
저온처리 기간별 실험결과 모든 처리구에서 특이적인 결과 를 볼 수 없었다. 저온처리 기간에 상관없이 상온에서 15~16 주 이상 경과해야 발아가 시작되었다. 즉, 저온 4주 처리는 저 온에서 4주 후 25℃로 옮긴 다음 16주가 경과해야 발아가 시 작되었고, 8주 처리도 역시 저온이 끝나고 25℃로 옮긴 후 16 주가 경과해야 발아가 시작되었다(Fig. 4). 실험 결과에 따르 면 섬쥐똥나무 종자는 저온층적처리로 휴면이 타파되지 않는 것으로 나타났다. 기존 연구에 의하면 생리적 휴면의 세부 유 형 세 가지 모두 저온층적처리로 휴면이 타파될 가능성이 있 지만, non-deep PD의 경우 종에 따라서 고온처리가 필요한 경우가 있다고 하였다(Baskin and Baskin 2004). 따라서 섬쥐 똥나무 종자는 non-deep PD유형일 가능성이 높기 때문에 이 를 증명하기 위한 온도별 발아율을 조사하였다.
온도조건에 따른 섬쥐똥나무 종자의 발아와 배의 신장을 알 아보기 위하여 온도 처리별 실험 T2(15℃), T3(20℃), T6(25→ 20→15℃), T5(5→15→20℃), T4(25℃), T1(5℃)순서로 발아가 이루어졌다(Fig. 5). T1(5℃)의 경우 20주가 지나도 발아를 하 지 않았던 반면에, T2(15℃)에서는 6주차에 발아를 시작하여 17주차에 약 88.3%의 최종발아율을 기록하였다. 발아율 상승 경향은 11주차까지 빠르게 상승하다가 12주차부터 상승폭이 줄어드는 경향을 보였다. T3(20℃)에서는 13주차에 발아를 시 작하여 19주가 경과된 후 98.8%, T6(25→20→15℃)처리에서 는 15주차에 발아를 시작하여 17주차에 98.8%, T5(5→15→2 0℃) 처리에서는 16주차에 발아를 시작하여 20주차에 31.6%, T4(25℃)항온 처리에서는 17주차에 발아를 시작하여 20주차 에 38.3%의 최종발아율을 기록하였다. 식물의 종자는 종에 따 라 휴면의 타파 조건으로 고온을 요구하기도 하고[Lesquerella lyrata Rollins (Baskin and Baskin 2000)], 저온을 요구하기도 하며[Echinacea angustifolia DC. var. angustifolia (Baskin et al. 1992)], 저온이 충족된 후 고온이 필요한 경우[Erythronium albidum Nutt. (Baskin and Baskin 1985)], 반대로 고온이 충 족된 후 저온이 필요한 경우[Jeffersonia diphylla (L.) Pers. (Baskin and Baskin 1989)]도 있다(Baskin and Baskin 2003b). 섬쥐똥나무 종자의 경우 15℃에서 발아가 가장 빨랐으며, 종 자의 저온층적처리(5-10℃) 온도보다 높은 상대적 고온(15℃) 에서 발아하였다(Baskin and Baskin 2003b; Baskin and Baskin 2004). 위 결과들을 종합해보면 섬쥐똥나무 종자는 물리적 휴 면과 형태적 휴면이 없고, GA3에 의한 약간의 영향을 받는 것 으로 보아 생리적 휴면으로 볼 수 있다. 또한 저온층적처리에 의한 휴면 타파효과가 없고, 상대적 고온(15℃)에서 빠르게 발 아하는 것으로 보아 생리적 휴면 중 non-deep PD유형에 속하 는 것으로 판단된다. 하지만 GA3에 의한 효과가 미미했기 때 문에 이를 보완, 확인하기 위하여 GA3처리 후 15℃에서 배양 을 하였다.
1000mg・L-1농도의 GA3를 처리한 후 15℃에서 암과 명으로 나누어 배양한 실험의 결과 10주차에 98.3%로 최종 발아율은 암처리와 광처리 모두 동일하게 나타났다(Fig. 6). Non-deep PD의 경우 GA3처리로 인한 휴면파타효과가 나타나는데(Baskin and Baskin 2004), 섬쥐똥나무 종자의 경우 GA3단독처리에서 는 큰 효과가 없었지만, 상대적 고온(15℃)과 함께 처리한 결과 발아소요일수가 단축되었다. 즉, GA3처리와 상대적 고온(15℃) 의 상호작용에 의하여 발아가 촉진되었다고 볼 수 있다. 따라 서 섬쥐똥나무 종자의 휴면유형은 non-deep PD에 속하는 것 으로 판단된다.