서 언

백합과에 속하는 옥잠화(Hosta plantaginea Asch.)는 내한 성이 강한 숙근초로 한국, 중국, 일본 등 동아시아지역에서 자 생하고 있다. 이러한 옥잠화는 서양에는 자생하지 않았으나 (Fujita 1976) 1800년대에 서양으로 건너가게 되면서 오늘날까 지 약 2,500여 종에 달하는 품종이 개발되었으며(Chung 1989) 꽃이 아름답고 잎의 모양이 다양하여 조경 및 화단 등의 관상 식물로 그리고 꽃꽂이용의 절엽 소재로 널리 이용되고 있다. 또한 옥잠화는 산성토양 및 반그늘이나 그늘에서도 잘 자라며 특히 뿌리가 잘 자라는 특징이 있어 경사지의 방토에 이용되 기도 한다(Lee et al. 2003). 산옥잠화(H. longissima), 비비 추(H. longipes), 일월비비추(H. capitata) 등 우리나라에도 자 생하는 옥잠화가 있음에도 불구하고 현재는 골든 티아라 (H.‘‘Golden Tiara’), 핼시온(H. ‘Halcyon’) 등 외국에서 육성된 품종이 고가로 역수입되어 국내의 시장을 잠식하고 있는 실정 이다(Ahn et al. 2007).

본 실험에 사용된 옥잠화 ‘조선’(H. plantaginea ‘Joseon’)은 1999년 7월에 (주)대양화훼종묘에서 국립종자원에 등록한 품종 으로 꽃은 8 ~ 9월에 흰색으로 피며 길게 나온 꽃대 끝에 여러 개가 피는데 향기가 있으며 저녁에 활짝 피어 아침에 진다.

옥잠화의 번식은 종자 또는 분주에 의해 이루어지고 있다. 그러나 종자에 의한 번식은 발아율이 저조하고, 그나마 분주 에 의해 주로 번식이 이루어지고 있으나 증식이 매우 느리고 한 해에 획득할 수 있는 영양번식체도 매우 적기 때문에 이러 한 번식 문제를 해결하기 위해서는 조직배양을 이용한 빠른 영양계 번식 체계의 확립이 필요하다. 지금까지 옥잠화의 조 직배양에 이용되고 있는 부위는 미성숙 꽃눈(Meyer 1980), 미 성숙 화서(Hill et al. 1989; Papachatzi et al. 1980), 정단 (Papachatzi et al. 1981), 그리고 자방(Van Tuyl et al. 1991) 등이 있다(Kim 2011). 이 중 정단배양은 식물체의 정단에서 적출한 엽원기가 붙은 정단분열 조직을 기내 배양하여 신초의 신장과 발근을 유도하여 어린 식물체를 대량으로 생산해 내는 영양번식 방법의 일종으로 모체와 유전적으로 동일한 개체를 생산할 수 있으며, 기내에서 신초를 분리하여 계대배양함으로 써 유식물체를 연중 대량으로 생산할 수 있는 번식 방법이기 도 하다(Kim et al. 1985).

신초 증식과 발근에 영향을 미치는 요인으로 배지의 구성성 분, 식물생장조절물질 등의 화학적 요인(Choi 2002)과 광, 온 도 그리고 습도 등의 환경 요인이 있다. Cytokinin은 지상부의 생육을 촉진하고 지하부의 발육을 억제한다고 알려져 있고 (Pennazio 1975), cytokinin 중 BA(6-benzylaminopurine)는 생리활성이 뛰어나 많은 화훼 작물의 조직배양에 주로 사용되 고 있다. 광, 온도 그리고 습도 등의 여러 환경 요인 중 광은 식물체의 생장에 큰 영향을 미치며(Cho et al. 2012) 잎과 줄 기의 생육뿐만 아니라 색소 형성과 투명화에도 관여하는 것으 로 알려져 있다(Debergh et al. 1992). 최근에는 사용하기 적 합하고 반영구적인 차세대 광원으로 각광 받고 있는 발광다이 오드(light emitting diode, LED)가 많이 사용되고 있는데 이는 환경친화적이며 광효율이 높고, 수명이 길며 에너지절감 효과 (Brown et al. 1995)가 있어 다양한 작물의 조직배양에 발광 다이오드를 이용하는 연구가 많이 진행되고 있다(Heo et al. 2010; Lee et al. 2010). 광질은 식물체의 신초 신장, 잎의 형 태 등의 생장 및 형태형성, 그리고 엽록소 합성에 영향을 미 친다고 보고되었다(Wongnok et al. 2008). 적색광은 신초와 줄기 생장(Shin et al. 2008), 그리고 청색광은 엽록소 합성 (Moreira da Silva and Debergh 1997)에 중요한 요인이며, 이 러한 광질은 식물생장호르몬의 농도 변화에 따라 신초 신장이 나 측지 발생에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Smith 1982). 그러나 조직배양 시 기내 유식물체의 생장 및 형태형성 에 대한 LED의 영향에 관한 연구는 그리 많지 않은 실정이다.

본 연구는 옥잠화 ‘조선’의 정단을 이용하여 기내 대량번식 체계를 확립하고자 신초 증식 적합한 무기염류 농도 및 배양 방법, cytokinin의 종류 및 농도, 광질 그리고 발근에 적합한 옥신의 농도 등의 효과를 구명하여 기내 번식체계의 기초자료 로 제시하고자 수행하였다.

재료 및 방법

충북 진천의 월드플라워컴퍼니에서 구입한 옥잠화 ‘조선’ (H. plantaginea ‘Joseon’)를 본 대학의 온실에서 분화로 재배 하여 공시재료로 사용하였다. 실험재료의 소독은 2% sodium hypochlorite 액에 약 10분간 침지하여 표면살균하고 멸균수 에 3회 수세하여 정단부를 현미경하에서 적출하여 배양하였 다. 모든 실험에 사용된 정단부는 엽원기 1 ~ 2매를 포함한 5mm 크기로 사용하였다.

정단배양을 위한 배양방법을 구명하기 위한 실험에서는 1MS배지를 기본으로 하여 이에 3% sucrose와 myo-inositol 0.1mg·L^-1을 첨가하였으며, pH 5.6으로 조정한 후 배양하였 다. 1MS기본배지에 생장조절물질로 0.2mg·L^-1 NAA와 BA, kinetin 1, 2, 4, 8mg·L^-1씩을 각각 혼용첨가 하였다. 배지는 시험관(25 × 150mm)에 filter paper bridge를 포함한 액체배 지, Drum shaker를 이용한 액체배지, agar 0.8%를 첨가한 반 고체배지를 이용한 3가지 처리방법으로 나누어 각 10mL씩을 분주하여 고압멸균기 121°C에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 배양실 환경은 23 ± 1°C, PAR 100 ± 5μmol·m^-2·s^-1 형광등 아래 16시간 조명(단 광질 실험은 제외)하였다. 시험관 당 1개 체를 치상하였고, 처리당 20병씩 3반복으로 6주간 배양하였다.

적합한 MS(Murashige and Skoog 1962)배지의 무기염류 농 도를 찾기 위해 다량원소의 농도를 달리한 1/2MS, 1MS 그리 고 2MS로 하였다. 각각의 배지에 3% sucrose, myo-inositol 0.1mg·L^-1를 첨가하였으며, pH 5.6으로 조정한 후 0.8% agar 를 첨가하여 배양병(52 × 110mm)에 50mL씩 분주하였고, 12 1°C에서 15분간 고압 멸균하였다. 모든 실험은 배양방법에 따 른 실험을 제외하고 배양병 당 3개체를 치상하였고, 처리당 10병씩 3반복으로 6주간 배양하였다.

Cytokinin 종류에 따른 실험은 1MS배지를 기본으로 하여 BA(6-benzylaminopurine), kinetin, TDZ(Thidiazuron) 각각의 1.0, 2.0, 4.0mg·L^-1에 NAA 0.2mg·L^-1를 혼용하여 처리하였 으며 3% sucrose를 넣고 pH 5.6로 조정한 후 0.8% agar를 첨 가하여 배양병(52 × 110mm)에 50mL씩 분주하였고, 121°C에 서 15분간 고압 멸균하였다. 모든 실험은 배양방법에 따른 실 험을 제외하고 배양병 당 3개체를 치상하였고, 처리당 10병씩 3반복으로 6주간 배양하였다.

광질에 따른 실험은 형광등(FL)을 대조구로 하였고, 적색광 (R, 630nm), 청색광(B, 460nm), 혼합광(R+B) LED[480 × 80 × 20 (W × D × H)mm, 220V/40W, Dynebio, Korea]를 사용하였다. 광도는 광도계(model BQM, Apogee Instrument, Inc. USA)를 이용하여 LED 광원부의 높이 조절로 110 ± 10μmol·m^-2·s^-1 로 설정하였고, 외부광원은 검은 천을 이용하여 차단하였으며 1MS기본 배지에 BA 4.0mg·L^-1 + NAA 0.2mg·L^-1가 첨가된 배지를 이용하였다. 배양 6주 후 신초수, 신초장, 엽수, 생체 중 및 건물중, 엽면적, 그리고 엽록소 함량 등을 조사하였다. 엽면적은 portable area meter(model LI-3000A, LI-COR, USA) 로 측정하였다. 엽록소 함량은 완전히 전개된 잎을 채취하 여 80%(v/v) aceton용액으로 추출하고, spectrophotometer (Genesis 2, Spectronic Unicam, USA)를 이용하여 흡광도를 측정한 후 Mackinney(1941)의 방법을 이용해 산출하였다.

형성된 신초들로부터 부정근을 유도하여 온전한 식물체를 재생시키기 위한 발근 배지로는 1MS기본배지에 NAA 0, 1.0, 2.0, 4.0mg·L^-1을 처리하여 5주간 배양한 후 발근율, 근수, 근 장, 신초장, 신초장, 엽수 등을 조사하였다.

실험의 결과들은 통계분석용 프로그램 SAS package (statistical analysis system, version 9.0, SAS Institute Inc.)를 이용하여 분석하였다.

결과 및 고찰

옥잠화 ‘조선’의 정단으로부터 신초 증식에 영향을 미치는 적절한 배양방법을 알아보기 위한 실험 결과는 Table 1에서 보는 바와 같았다. 생존율은 모든 처리구에서 100%였다. 배 양기를 이용한 액체배지(liquid media with drum shaker)와 반고체배지(semi solid media)의 BA 4.0mg·L^-1 + NAA 0.2mg·L^-1 처리구에서 2.4개로 가장 많게 나타났다. 신초장 은 회전배양기를 이용한 액체배지의 kinetin 8.0mg·L^-1 + NAA 0.2mg·L^-1 처리구에서 4.1cm로 가장 크게 자랐으며 엽 수는 회전배양기를 이용한 액체배지의 BA 4.0mg·L^-1 + NAA 0.2mg·L^-1 처리구와 반고체배지의 BA 8.0mg·L^-1 + NAA 0.2mg·L^-1 처리구에서 5.6매로 가장 많았다. 필터페이퍼를 이용한 액체배지(liquid media with filter paper bridge) 처리 구의 신초 생육은 다른 처리구에 비해 가장 저조하였으며 cytokinin의 농도는 신초 증식에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 회전배양기를 이용한 액체배지 처리구의 신초는 필 터페이퍼를 이용한 액체배지와 반고체배지에서 배양한 것보 다 생장 속도가 조금 더 빠른 반면 잎이 투명해지는 유리화 현상이 일부 나타났다. 배지가 묽거나, cytokinin농도가 높거 나 높은 무기질농도에서 유리화가 나타난다고 하였다(Choi 2002). 본 실험의 경우 높은 cytokinin농도에선 유리화가 나타 나지 않은 것으로 보아 액체배지의 영향으로 유리화가 나타나 는 것으로 생각된다. 또한 회전배양기를 이용한 액체배지 처 리구에서는 신초 형성이 모든 방향으로 일정하지 않게 발생하 는 경향을 보였다(Kim 2011; Yu and Wang 1996). 이는 회전 식 배양으로 인해 생장점의 극성이 깨어진 결과일 것으로 판 단된다.

고체배지는 액체배지보다 절편체의 고정이 용이하여 신초 가 같은 방향으로 자랄 수 있고 식물체가 배지 위에 있어 공 기의 공급이 원활하다는 장점이 있다. 한편 액체배지는 절편 체가 고루 배지내의 양분을 이용할 수 있는 장점이 있으나 절 편체나 유식물체가 액체 속에 잠겨있어 산소공급이 부족하게 되는 단점이 있다. 옥잠화 기내배양에서 신초 재생이 가장 높 았다고 보고된 부위는 정단, 꽃눈, 그리고 엽병의 아랫 부분이 었으며 반고체배지, 필터페이퍼를 이용한 액체배지, 그리고 액체배지의 다양한 배양방법에 대한 실험에서 필터페이퍼를 이용한 배지에서 가장 높은 신초 증식을 보인 반면에 유리화 현상이 나타난다고 보고하였으나(Lubomski 1989a; 1989b) 이 는 본 실험의 결과와 다르게 나타났다. 그러나 고체배지에서 의 유리화 현상없이 높은 신초 증식을 보인 결과는 본 실험의 결과와 유사하였다. 따라서 고체배지가 액체배지보다 신초 증 식에 양호한 것으로 판단되어 다음의 모든 실험에서 고체배지 를 사용하였다.

옥잠화 ‘조선’의 적합한 MS배지의 무기염류 농도를 찾기 위 해 다량원소의 농도를 달리한 1/2MS, 1MS 그리고 2MS배지에 따른 신초의 생육은 Table 2에서 보는 바와 같았다. 생존율은 3처리구 모두 100%였다(데이터 미제시). 1/2MS배지에서 근 수, 근장, 생체중, 건물중이 가장 높은 경향을 나타내었으며 이는 신초의 생육보다 뿌리의 생육이 양호하여 높게 나타난 결과로 보인다. 1MS 배지와 2MS배지에서 신초수는 각각 1.4 개, 엽수는 각각 4.4매, 4.3매로 모두 양호하게 나타났다. 1MS 배지에서는 신초 및 뿌리 생육이 동시에 양호하게 나타나 생 체중과 건물중이 높게 나타나는 경향을 보였으며 반면에 2MS 배지에서는 신초 생육만 양호하게 나타나 생체중과 건물중이 가장 낮은 결과를 보였다. 1MS배지에 있어 다량원소의 농도 가 높을수록 근수와 근장은 감소하는 경향을 보인 반면에 엽 수는 증가하는 경향을 보였다. 바위떡풀의 기내 배양시 MS 배 지의 다량원소 농도가 높을수록 엽수는 감소하였고 근수와 근 장은 증가하였다는 보고가 있으나(Suh et al. 2010) 이는 본 실험의 결과와 상반되는 것으로 나타났다. 따라서 옥잠화 ‘조 선’의 기내 배양시 신초 증식에는 2MS배지보다 1MS배지가 효 율적인 것으로 판단된다.

Cytokinin의 종류 및 농도에 따른 옥잠화 ‘조선’의 기내 생장의 결과는 Table 3과 Fig. 1에서 보는 바와 같았다. 생 존율은 모든 처리에서 100%였다(데이터 미제시). Kinetin 2.0mg·L^-1 + NAA 0.2mg·L^-1 처리구와 kinetin 4.0mg·L^-1 + NAA 0.2mg·L^-1 처리구에서 신초수와 신초장 각각 3.4개, 3.3 개 그리고 4.1cm, 4.1cm 로 가장 높게 나타났다. 또한 kinetin 4.0mg·L^-1 + NAA 0.2mg·L^-1 처리구에서 엽수 7.4, 생체중 813.3mg, 건물중 108.0mg 등으로 가장 높은 경향을 보였다. Kinetin처리구에서의 생체중과 건물중은 BA와 TDZ처리구의 생체중과 건물중에 비해 높게 나타났다. 이는 절단면에 캘러 스와 유사한 조직의 발생과 뿌리의 발생으로 높게 나타난 결 과로 보인다. 또한 kinetin처리구에서는 다른 두 처리구와 다 르게 엽신에 비해 엽장이 길게 나타나 신초들이 웃자란 것처 럼 엉성한 모양을 보이고 신초의 발생도 상하좌우 다방면으로 발생하여 계대배양시 물리적인 상처나 공기 중의 장시간 노출 로 인해 오염될 수 있기 때문에 증식을 위해서 계대배양 할 경우에는 BA 4.0mg·L^-1 + NAA 0.2mg·L^-1 처리구가 적합할 것으로 생각된다. 이런 경향은 국내육성 거베라 배양에서도 나타났다(Cho et al. 2012). BA와 TDZ의 농도가 높을수록 신 초수와 신초장이 증가하는 경향을 보였다. 본 실험에 있어서 정단배양시 배양방법에 따른 처리구에서 일부 유리화가 나타 났으나 계대배양시에는 cytokinin의 종류 및 농도에 관계없이 유리화가 나타나지 않았다. 본 실험에서 유리화는 cytokinin의 영향이 아니라 액체배지의 영향인 것이 확인되었다. Cytokinin 은 뿌리의 발육을 억제하지만 줄기의 생육을 촉진한다는 보고 (Pennazio 1975)가 있으나 cytokinin의 종류 및 농도에 따라 그리고 식물체에 따라 그 결과가 다른 양상을 나타내고 있으 므로 식물체에 따라 신초를 효율적으로 유도하기 위해서는 cytokinin의 종류 및 농도 선택에 있어 신중히 고려를 해야 한 다고 생각된다.

광질에 따른 옥잠화 ‘조선’의 기내 생장의 결과는 Table 4에 서 보는 바와 같았다. 생존율은 모든 처리에서 100%였다(데이 터 미제시). 형광등 처리구에서 신초수 2.2개, 신초장 2.6cm, 엽수 4.9장, 생체중 254.3mg, 건물중 31.4mg, 엽면적 4.1cm² 인데 반해 적색광 처리구에서 신초수 2.9개, 신초장 3.2cm, 엽수 5.7장, 생체중 361.3mg, 건물중 36.2mg, 엽면적 5.7cm² 로 가장 높게 나타났으나 엽록소의 함량은 형광등처리구보다 가장 낮게 나타났다. 덩굴용담(Moon and Park 2008)과 펠라 르고늄(Maigull 1990)에서 적색광이 줄기의 신장을 증가한다 고 하였는데 본 실험에서도 엽병의 신장이 관찰되었다. 엽록 소의 함량은 청색광 처리구에서 가장 높게 나타났으나 신초수 나 신초장은 낮게 나타났다. 그러나 청색광 처리구에서 자란 식물체는 강건한 모습을 보이는 경향이 있다. Shin et al. (2008)도 청색광에서 자란 식물에서 엽록소 함량이 높게 나타 난다고 보고하였다. 본 결과에서도 청색광이 엽록소 함량에 간접적으로 영향을 미치는 것으로 나타났다. Wongnok et al.(2008)은 광질이 식물체의 신초 및 잎의 생장 및 형태형성, 그리고 엽록소 합성에 영향을 미친다고 보고하였고 Shin et al.(2008)은 적색광이 신초와 줄기생장에 영향을 미친다고 보 고하였다. 그리고 Moreira da Silva and Debergh(1997)는 청 색광이 엽록소 합성에 중요한 요인이라고 보고하였으며, Smith(1982)는 이러한 광질은 식물생장조절물질의 농도 변화 에 따라 신초의 신장이나 측지 발생에 영향을 미친다고 보고 하였다.

NAA 농도에 따른 옥잠화 ‘조선’의 기내 뿌리 생장의 결과는 Table 5에서 보는 바와 같았다. 생존율은 모든 처리구에서 100%였다(데이터 미제시). 옥잠화 ‘조선’의 기내 뿌리 생장은 NAA가 포함되지 않은 배지에서 가장 좋게 나타났다. NAA 무 처리구에서는 발근율이 100%였으나 NAA 1.0mg·L^-1 처리구 에서 13.3%, NAA 2.0mg·L^-1 처리구와 NAA 4.0mg·L^-1 처리 구에서는 전혀 발근이 이루어지지 않았다. 이러한 결과는 Paek et al.(1996), Saito and Nakano(2002)의 연구에서도 유 사한 결과를 보였다. 또한 NAA 무처리구에서는 엽병보다 엽 신의 생육이 양호하게 나타났고 NAA 1.0mg·L^-1 처리구에서 는 엽신보다 엽병이 생육이 양호하게 보였다. NAA 농도가 높 아질수록 지하부 및 지상부 생육이 감소하는 경향을 보였다. NAA는 발근에 중요하게 작용하지만 본 실험에 있어 옥잠화 ‘조선’의 기내 발근에는 크게 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 이는 발근을 위해 외생 옥신을 처리한 결과 발근이 이루어지 지 않은 것은 발근을 위한 충분한 양의 옥신이 옥잠화 내부에 존재하는 것으로 보이므로 옥잠화 발근에는 외생옥신 처리가 효과가 없는 것으로 생각된다. 그러나 옥신은 Echinacea purpurea 등 일부 식물의 부정근 발생에 효과적(Oh et al. 2007)이어서 식물마다 큰 차이가 있는 것으로 보인다.

결론적으로 옥잠화 ‘조선’정단 1개를 BA 4.0mg·L^-1 + NAA 0.2mg·L^-1 또는 kinetin 4.0mg·L^-1 + NAA 0.2mg·L^-1 가 첨 가된 MS고체배지에서 1년동안 계대배양 할 경우에 6,561개 이상의 식물체를 만들 수 있을 것으로 생각된다.

본 연구의 결과, 무기염류농도, 배양방법, cytokinin의 종류 및 농도, 광질, NAA가 옥잠화 ‘조선’의 기내 배양시 신초의 생 장 및 형태형성에 분명히 영향을 미치는 것으로 보였으며 조 직배양 시 적절한 배지 및 cytokinin의 선택, 그리고 광질은 기내 신초의 정상적인 생육을 위해 필요하며 향후 기내 신초 의 소질을 높일 수 있는 요인이 될 수 있어 본 실험의 결과는 향후 옥잠화 ‘조선’의 기내 대량 증식을 위한 기초자료로 활용 할 수 있을 것이다.