서 언

국화(Chrysanthemum morifolium)는 세계에서 가장 많 이 재배되고 있는 화훼류 중 하나로서 화훼산업에 있어 서 장미 다음으로 경제적 중요도가 높은 작물이다(Hübner 2014). 국화의 국내 재배면적은 2013년 489 ha로서 화훼 작물 중 가장 많이 재배되고 있으며, 수출액은 2014년 472만불로서 화훼수출의 약 11.6%의 비중을 차지하고 있 다(ATKATI 2015; MAFRA 2014). 국화는 품종에 따라 서 화색, 화형, 꽃의 크기 및 형태 등이 매우 다양하기 때문에 절화, 분화 및 화단용 등 여러 가지 형태로 판 매되고 있으며, 더욱 다양한 형태의 국화에 대한 요구가 높아지면서 경쟁력 있는 국산 품종 개발을 위한 노력이 증가하여 왔다. 국립종자원에 등록품종은 2011년 375개 에서 2015년 652개(KSVS 2015)로 증가하였으나, 아직 까지는 육종선진국인 네덜란드나 일본 등에 비하여 상업 적 가치를 지닌 품종들은 많지 않은 실정이다.

국화는 분류학적으로 Asteraceae과에 속하며 북유럽 및 아시아가 원산지로서 대부분의 종들이 중국을 중심으로 한 동아시아에서 생성되었다(Liu et al. 2012). 국화의 재 배역사는 약 3000년에 이르며 오랜 재배기간을 거치면 서 자연선택 및 인공교배 등을 통하여 많은 품종들이 생 성 되어왔다(Wolff and Petersvanrijn 1993). 따라서 꽃의 형태적 다양성이 매우 크고, 게놈은 2배체부터 10배체까 지 폭넓은 형태로 존재한다. 현재 대부분의 재배종은 이 질육배체(allohexaploid, 2n = 6x = 54)이나, 감수분열 중기에 2가 염색체 쌍(bivalent pairing)이 두드러지면 간혹 이수 성(aneuploidy) 형태도 나타나는 것으로 알려져 있다(Chen et al. 2009; Tang et al. 2009; Watanabe 1977). 또한 국화는 약 9.4Gb에 이르는 높은 게놈크기와 함께 고도의 이형접합성을 가진 타식성 작물이다(Bennett and Leitch 2012). 이처럼 큰 게놈크기와 복잡한 유전적 배경은 국 화에 대한 육종 및 유전체 연구를 제한하는 주요인이 되 어왔고, 따라서 국화의 유전체관련 데이터 역시 다른 작 물에 비하여 매우 적은 실정이다.

최근 생명공학 기술의 발달에 따라 DNA 단편의 다형 성을 이용하는 분자생물학적 분석기술이 식물의 유전적 다 양성 평가 및 육종 효율 증진을 위해 활용되고 있다. DNA 마커를 이용한 분석방식은 식물의 형태적 특성에 상관없이 빠르고 정확하게 유전적 특성의 평가를 가능하게 한다. 주 요 DNA 마커의 종류에는 RAPD(Randomly Amplified Polymorphism DNA), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism), SNP(Single Nucleotide Polymorphism), STS(Sequence Tagged Site) 및 SSR(Simple Sequence Repeat) 등(Hayward et al. 2015; Poczai et al. 2013)이 있으며 이러한 분자생물학적 분석기술들이 유전적 다양성 의 평가, 품종분류 및 육종에 활용되고 있다. 이중 SSR 은 식물 게놈 전체에 걸쳐서 분포하고 있는 단순반복 염 기서열의 motif 반복횟수에 의해 차이가 나타나기 때문 에 높은 다형성(polymorphism) 정도를 나타낸다. 따라서 SSR 마커는 식물의 유전적 다양성과 품종간 유연관계 평 가를 위해 가장 많이 이용되는 분석기술 중 하나이다.

국화의 경우, 육종을 위한 목적형질은 화색, 화형, 초 세, 개화기, 절화수명 및 병해 저항성 등으로 다양하며 그 중에서도 화색은 경쟁력 있는 신품종육성을 위해 가 장 중요한 형태적 특성이다. 그러나 국화의 이러한 형태 적 특성들은 재배환경에 의해 영향을 받기 때문에 표현 형(phenotype)만으로는 유전적 특성이 유사한 근연종 간 의 분류가 어렵다. 따라서 분자마커 기술을 접목하여 유 용형질을 포함한 유전자원을 스크리닝하고 분자육종소재 를 개발하여 육종효율을 증진시킬 필요가 있다. 그러나 현재까지 국화에 있어서는 표현형과 SSR 마커 분석에 의 한 유연관계간의 상관관계를 비교하려는 노력이 거의 없 었다.

본 연구에서는 먼저, 국화의 표현형 분류체계를 확립 하여 국내외에서 상업적인 가치가 높은 국화재배종들을 형태적인 특성에 기반하여 분류하였고, 다음으로 SSR 마 커를 이용하여 그들의 유전적 근연관계를 분석하였으며, 끝으로, 원예적으로 중요한 표현형질과 SSR 마커 사이 의 비교를 통하여 동일한 형태적 특성내에서의 균일성을 확인하고자 수행하였다.

재료 및 방법

식물재료

식물재료는 세종대학교 농장에서 도입하여 재배하고 있 는 국화 중 상업적 가치가 높은 품종들에 대하여 화색, 화형 및 크기 별로 60 품종을 선발하여 이용하였다. 선 발된 국화품종은 대부분 스프레이 타입(52품종)이었고, 스 탠다드 타입 2품종, 디스버드 타입 3품종, 관상국 3품종 이 포함되었다(Table 1).

표현형 조사기준 설정

국화 육종에 활용될 수 있는 표현형질의 조사를 위하 여 화기, 화뢰, 화심, 화판, 잎, 줄기, 생장 등 7개의 카 테고리를 설정하고, 총 38개의 형질특성 항목을 설정하 였다(Table 2). 국화 화색은 색상이 혼합되거나 육안으로 판단하기 어려운 중간색상 등이 있기 때문에 이미지분석 소프트웨어(ImageJ 1.60, National Institutes of Health, USA)를 이용하여 꽃 이미지로부터의 RGB값을 측정하였 다(Fig. 1). 화심의 모양은 꽃의 횡단면을 분석하였고, 꽃 과 잎의 형태 및 크기 등도 이미지분석 소프트웨어를 이 용하여 측정하였다(Fig. 1, 2). 화형, 화서, 화판 및 잎의 형태 등은 UPOV 가이드라인을 참고하여 조사기준을 설 정하였다(UPOV 2010).

DNA추출 및 PCR분석

생육중인 국화의 어린잎을 채취하여 genomic DNA 분 리에 사용하였다. 어린잎 0.2g을 2개의 bead가 들어있는 2mL 튜브에 넣고 extraction buffer와 함께 TissueLyser (TissueLyser II; Qiagen, Hilden, Germany)로 분쇄한 후 Murray and Thompson (1980)의 방법에 따라서 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영 동하여 정량하였고, 20ng/ml로 희석하여 PCR분석에 이 용하였다.

PCR 반응을 위하여 국화 DNA 20ng, forward와 reverse primer 각각 0.3mM, 1X PCR buffer, 0.2mM dNTPs, 그 리고 Taq polymerase 1unit이 포함된 혼합액(20ul)을 만들 었다. PCR 반응은 Veriti thermal cycler(Model 9902, Applied Biosystems, Singapore)를 이용하여 94°C에서 30초 (denaturation), 50-60°C에서 30초(annealing), 72°C에서 45초 (extension)의 조건으로 35-40cycle 수행되었다. 각 프라이 머별 최적의 PCR 반응조건(annealing temperature 및 PCR cycle)은 실험을 통하여 Table 4와 같이 설정하였다. PCR증폭산물은 3% agarose gel을 사용하여 1X TAE buffer에서 전기영동(160volt/2시간)하여 분리하였고, Red Safe(Intron Biotechnology, Seoul, Korea)로 염색한 후 Gel imaging system(Davinch-K, Seoul, Korea)를 이용 하여 DNA 단편을 관찰하였다.

SSR 마커 선발

SSR 마커를 선발하기 위하여 기존 연구에서 보고된 프 라이머 62개와 함께Chrysanthemum nankingense Unigene 과 Chrysanthemum morifolium EST 염기서열로부터 각각 20개와 68개의 프라이머를 디자인하여 총 150개의 SSR 마커를 분석에 이용하였다(Table 3). Unigene과 EST 염기 서열은 NCBI database에서 추출하였고, SSRs의 탐색 및 프라이머 디자인을 위하여 BatchPrimer3(You et al. 2008) 를 사용하였다. SSR 마커의 다형성을 조사하기 위하여 화 색과 화형이 각기 다른 8개의 품종(‘Annecy Yellow’, ‘Art’, ‘Bridal White’, ‘Cheeks Dark’, ‘Fire pink’, ‘Helios’, ‘Java’, ‘Magna’)을 선발하여 이용하였다.

데이터 분석

SSR 마커의 다형성을 조사하기 위하여 각 마커의 polymorphism information content(PIC) 값을 다음의 식 에 의하여 계산하였다.

PIC=1− ∑ i = 1 n P i 2

수식에서 n은 총 대립유전자의 수, P_i는 _i번째 대립유 전자의 빈도수를 나타낸다(Anderson et al. 1993).

국화 60품종에 대한 유연관계를 비교하기 위하여 밴드 의 유무(유 = 1, 무 = 0)에 따른 dada matrix를 작성한 후 NTSYS-pc software v2.2를 이용하여 UPGMA(unweighted pair group mean algorithm) 방법(Rohlf 2008)에 의한 dendrogram을 작성하여 분석하였다. SSR 마커와 화색과 의 관계를 조사하기 위하여 SPSS 18.0 software(IBM, Somers, NY, USA)를 이용하여 stepwise방식에 의한 다중 회귀분석(MRA)을 하였다. MRA를 위하여 화색을 숫자로 변환(white = 1, yellow = 2, red = 3, pink = 4, green=5)한 후 종속변수(dependent variable)로 입력하였고, SSR 마커 데이터를 독립변수(independent variable)로 입력하여 분 석을 수행하였다. 독립변수간의 다중공선성의 회피를 위 하여 tolerance와 VIF(variance inflation factor) 값을 확 인하여 변수를 제외하였다.

결과 및 고찰

표현형에 따른 유연관계 분류

주요 국화 표현형 분석 결과를 Fig. 3에 나타냈다. 화색 은 황색계열이 17품종으로 가장 많았고, 분홍색(16품종), 백 색(12품종), 녹색(11품종), 적색(3품종)의 순으로 나타났다 (Fig. 3A). 화형은 홑꽃(single)과 겹꽃(double)이 각각 22 품종, 21품종으로 대부분을 차지하였고, 폼폰(pompon)이 13품종으로 그 다음이었으며, 아네모네(anemone) 타입은 4품종만이 포함된 것으로 나타났다(Fig. 3B). 꽃 크기는 6-7cm와 4-5cm 그룹에 39품종이 포함되었고, 8-10cm의 대형화도 9품종 포함된 것으로 나타났다(Fig. 3C). 화판 형태는 육종에 있어서 중요한 형질 중에 하나인데, 타원 형(ligulate)이 40품종으로 전체의 약 67%를 차지하였고, 안으로 굽은형태(incurved)가 15품종이었으며, 주걱모양 및 빨대모양은 5품종인 것으로 나타났다(Fig. 3D). 화서 형 태에 있어서는 산방화서(corymbiform)와 평평한 산방화서 (flat-corymbiform)에 대부분의 품종(39품종)이 포함되었고, 심한 반구형(deeply domed)에도 14품종이 포함된 것으로 나타났다(Fig. 3E). 국화 초장의 범위는 21cm에서 130cm 였다. 초장은 중간 크기인 81-100cm와 61-80cm가 각각 20품종과 14품종으로 절반 이상을 차지하였으나, 100cm 이상의 국화도 12퓸종이 포함된 것으로 나타나서 품종에 따른 다양성이 매우 큰 것으로 나타났다(Fig. 3F).

본 연구에서 총 38개의 형질을 기반으로 측정된 국화 60품종의 표현형 데이터에 대한 군집분석을 행한 결과, 대부분의 품종들이 화색과 화형 별로 8개의 그룹으로 분 류되는 것으로 나타났다(데이터 생략). 이러한 결과로 볼 때 본 연구에서 선발된 60개의 국화 품종에 있어서는 화 색과 화형이 품종간 유연관계를 구분하는 가장 중요한 표 현형질인 것으로 생각된다.

SSR 마커 선발

국화 품종의 유연관계 분석에 효과적인 SSR 마커를 선 발하기 위하여 기존 연구에서 다형성이 높은 것으로 보 고된 62개의 프라이머 염기서열을 수집하였다(Moe et al. 2011; Wang et al. 2013; Wang et al. 2014; Xu et al. 2013). 또한 야생종인 Chrysanthemum nankingense의 unigene 염기서열에서 20개, 재배종인 Chrysanthemum morifolium의 EST 염기서열로부터 68개의 프라이머를 디 자인하여 총 150개의 SSR 마커를 이용하여 8개 국화 품 종을 대상으로 PCR을 수행하였다(Table 3). 분석결과, 6 배체인 ‘Smileball’에서 개발되어 재배국화의 품종분류에 효과적이었던 것으로 보고된 마커들(Hong et al. 2013; Khaing et al. 2013)은 본 연구에서 사용된 국화 품종들 에서는 다형성이 낮거나 PCR 반복 재현성이 떨어졌다. 반면에 NCBI의 EST 염기서열로부터 디자인된 마커들과 2배체 야생종인 C. nankingense에서 개발된 마커들(Wang et al. 2013; Wang et al. 2014)에서 비교적 높은 다형성 과 PCR 반복 재현성이 관찰되었다. 명확한 banding pattern을 보이는 마커들 중 다형성이 높은 총 13개의 SSR 마커(EST8-93, NK99-313)를 최종 선발하였다. 선발 된 SSR 마커를 이용하여 국화 60품종에 대한 다형성 정 도를 조사한 결과, PIC 값은 0.52-0.81의 범위였고, 평 균값은 0.68로 조사되어(Table 4), 국화 품종의 유전적 다 양성 분석에 활용 가능할 것으로 판단되었다.

유연관계분석 및 표현형과 SSR 마커 간의 상관관계 분석

국화 60품종에 대한 유전적 유사도를 조사하기 위하여 SSR 마커를 이용하여 군집분석을 행하였다. Phylogenetic tree를 작성하여 분석한 결과, 모든 품종이 13개의 SSR 마커의 유전자형에 따라 구분되는 것으로 나타났다(Fig. 4A). 국화 품종의 유연관계분석을 위해 SSR 마커를 이 용한 대부분의 연구에서는 야생종, 재배종 및 육성계통 등 다양한 유전자원을 이용하였기 때문에 집단내의 유전 적 다양성이 비교적 컸다(Jo et al. 2015; Khaing et al. 2013; Moe et al. 2011; Wang et al. 2013; Zhang et al. 2014). 반면에 본 연구는 ‘Baekma’를 포함한 대부분 상업적 재배종을 이용하였음에도 불구하고, 모든 품종이 구별됨으로써 국화 유연관계 분석을 위한 SSR 마커의 효 과를 뒷받침하였다.

한편, UPGMA dendrogram은 유사도값 0.59를 기준으 로 6개의 그룹으로 분류되었다(Fig. 4A). SSR 마커에 의 해 분류된 6개의 그룹을 표현형 데이터와 비교한 결과 화 색과 화형에 의하여 그룹이 나누어진 것으로 나타났다(Fig. 4B). 제1그룹은 ‘Quebec’을 포함하여 녹색계통의 12품 종이 모두 포함되었고, 흰색에 녹색이 혼합된 ‘Zembla lime’(Fig. 2F)도 1그룹에 포함되는 것으로 나타났다. 제2 그룹은 분홍색 계통 중 폼폰타입 3품종으로 구성되었다. 제3그룹은 23개의 품종이 포함되었으며, 3개의 하위그룹 으로 분류되었다. 첫번째 하위그룹은 황색 계통 중 겹꽃 6품종, 두번째 하위그룹은 분홍 및 적색 계통 중 아네 모네, 겹꽃, 홑꽃 형태의 11품종, 세번째 하위그룹은 황 색 홑꽃 6품종으로 구성된 것으로 나타났다. 제4그룹은 분홍 및 적색 계통 중 홑꽃 타입의 5품종이 포함되었다. 제5그룹의 경우는 다양한 화형을 가진 흰색 계통 12 품 종이 모두 포함되었다. 제6그룹은 황색 계통 중 폼폰 타 입으로 구성되었으며, 노랑 배경에 녹색이 혼합된 ‘Loving you’도 포함되었다.

이상의 결과는 SSR 마커에 의하여 국화 60품종이 화 색을 기준으로 그룹이 분류되고동일한 화색 내에서도 화 형이 다를 경우 하위그룹으로 구분됨으로써 SSR 마커와 화색과의 밀접한 관련성을 나타냈다. 양자간의 상관관계 를 명확히 하기 위하여 SSR 마커를 독립변수로, 화색을 종속변수로 하여 MRA를 수행하였다. 그 결과, stepwise 방법에 의하여 선택된 8개의 독립변수들에 의하여 종속 변수의 약 90%가 설명(r² = 0.903, P < 0.05)됨으로써 고 도의 상관관계가 나타났다(Table 5). 편회귀계수(Partial regression coefficient)는 종속변수가 8개의 독립변수와 모 두 통계적으로 유의한 관계임을 보여주었고, 표준편회귀 계수(Standard partial regression coefficient)는 가장 큰 값(–0.60)을 보인 NK312이 SSR 마커들 중 화색 판별에 가장 중요한 기여를 하고 있는 것으로 나타났다.

국화에서 SSR 마커에 의한 phylogenetic tree와 표현 형과의 상관관계를 분석하기 위한 연구들을 보면, 국화의 이용형태(관상국, 스탠다드, 스프레이, 분화용, 화단용)에 따 른 분류(Hong et al. 2013; Khaing et al. 2013), 화색 이나 꽃 크기(Jo et al. 2015), 화색, 화형, 화판형태와 육성시기(Zhang et al. 2014) 및 품종유래(Wang et al. 2013) 등을 기준으로 한 분류들이 시도되어왔다. 그러나 공시품종들이 특정 표현형질에 따라 분류 및 그룹화된 경 우도 있었으나, 다수의 요인이 복잡하게 작용하거나, 그 룹구성의 요인이 특정되지 못하는 경우도 적지 않았다. 반면에 본 연구는 phylogenetic tree에 의한 국화 60품종 의 그룹화가 화색에 따라 명확하게 이루어졌을 뿐만 아 니라, 선발된 SSR 마커들이 화색 변화와 밀접한 상관관 계를 가지고 있음을 증명하였다.

본 연구결과는 국화에서 가장 중요한 표현형질 중 하 나인 화색과 SSR 마커와의 상관관계를 밝힘으로써 국화 신품종 육성을 위한 데이터로 활용될 수 있을 뿐만 아 니라, 재배 품종들의 품종보호 및 종자관리를 위한 데이 터로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.