서 언
프리지아(Freesia hybrida)는 붓꽃과 프리지아속에 속하 며 남아프리카 원산의 구근화훼식물로, 다양한 화색과 은 은한 향기로 국내외에서 절화 및 분화로 많이 사용하고 있다(Cho et al. 2015; Wang 2006). 프리지아 구근은 변 형된 줄기가 비대하여 형성된 원추형의 인피구경으로 우 리나라에서는 11월부터 다음해 4월말까지 전국에서 재배 및 유통되는 대표적인 겨울 화종이다(Cho et al. 2011). 과거 국내 절화용 프리지아는 네덜란드에서 육성된 반겹 꽃 ‘Yvonne’ 품종이 많이 점유하고 있었으나, 구근을 전 량 수입해야 했기 때문에 생산비에서 구근 구입비 비중 이 매우 크게 차지하였다(Cho et al. 2011; Kim et al. 1997). 그러나 국립원예특작과학원에서 1999년부터 다양 한 품종을 육성하고자 노력한 결과 2003년 황색 겹꽃 ‘Shiny Gold’를 시작으로 다양한 화색의 국산 품종이 개 발되어 국내외 시장에서 호평을 받기 시작하였다(Cho et al. 2011). 2013년 국산 품종의 보급률은 38%에 달하고 있으며 수출도 2012년 100만본을 달성하여 농가소득을 높 이고 있다(Cho 2007; Cho et al. 2015). 그러나 국내 육성 품종이 보급되고 7, 8년이 지나자 품질과 수량이 감 소되는 문제가 발생되고 있다(Ko et al. 2003). 고품질의 프리지아를 지속적으로 생산하기 위해서는 바이러스에 감 염되지 않은 무병구를 사용하는 것이 필수적이다(Foxe 1993; Kim et al. 1997). 바이러스에 감염되어 있는 식 물체로부터 무병구를 생산하기 위해서는 정단부에 있는 생장점을 따서 기내에서 유식물체를 얻는 방법이 많이 이 용되고 있다(Kim et al. 1997; Ko et al. 2003). 이렇게 얻어진 유식물체는 조직배양기술을 이용하여 기내에서 급 속 대량증식하고 순화시켜서 무병 건전묘를 생산하는데 이용된다(Liu and Burger 1986). 이런 과정에서 유식물 체 또는 부정아를 짧은 기간에 많이 발생시키는 기술이 무엇보다도 중요하게 된다.
조직배양시 부정아 발생 정도는 절편체 종류, 생장조 절제, sucrose 농도 및 광주기 등 다양한 요인에 의해 영 향을 받는다(Han and Kim 2009; Lim et al. 2005; Nam et al. 2005; Park et al. 2005). 프리지아의 조직 배양에 관한 연구에서 대량증식을 위한 적정 호르몬(Ko et al. 2003)과 무기염류와 생장조절 물질(Kim et al. 1997)에 관한 연구 결과가 보고 되었다. 하지만 지금까 지 구경 절편체를 어떻게 치상했을 때 부정아 발생 효 율이 높은가에 대한 연구는 전무한 실정이다. 국화에서 부정아 유도시 마디를 수직으로 또는 수평으로 치상하는 방법에 따라서 부정아 유기가 달라졌으며(Lim et al. 2005), 복숭아 조직배양 시 신초 정단분열조직을 제거하 고 수평으로 치상하는 경우가 신초의 정단분열조직을 그 대로 두고 수평으로 치상하거나 수직으로 치상하는 경우 보다 신초 증식에 더 효과적이라는 보고가 있었다(Jun et al. 1998; Yae et al. 1987). 이와 같이 절편체를 어떻게 치상하느냐에 따라 캘루스나 부정아 발생이 크게 달라질 수 있다.
본 연구에서는 국내에서 육성된 프리지아의 좀 더 효 율적인 기내 급속대량 증식기술을 찾기 위한 목적으로 실 험을 수행하던 중 구경 절편체를 상하 거꾸로 배지에 치 상하였을 때, 부정아와 신초 발생이 획기적으로 증가하 는 것을 알게 되었기에 보고하고자 한다. 동시에 절편체 치상방법을 달리 했을 때 호르몬의 유무가 부정아와 신 초 발생 정도에 미치는 영향도 관찰하였다.
재료 및 방법
식물재료
국립원예특작과학원 화훼과에서 육성된 프리지아 ‘Shiny Gold’와 ‘Gold Rich’ 두 품종을 이용하였다. 하늘화훼종 묘로부터 프리지아 구경(직경 1 ± 0.2cm)을 품종별로 분 양 받아 사용하였으며 실험에 이용하기 위해서 소독을 실 시하였다. 70% 에탄올에 3분간 처리하고 Tween 20을 첨 가한 2% NaOCl에 20분 동안 처리하였다. 매 처리마다 멸균수로 구경을 3회 정도 세척하였다. 소독이 끝나고 멸 균된 filter paper에서 건조시킨 후 1/2 MS배지(호르몬 무첨가)에 치상하고 23℃ 배양실에서 암 상태로 배양하 였다. 10일 경과 후 오염이 발생하지 않은 건전한 구경 을 선발하여 실험에 사용하였다.
호르몬 처리와 치상 방법
배지는 MS 기본배지만 이용한 대조구와 MS배지에 5.0mg • L−1 NAA + 5.0mg • L−1 Kinetin 을 첨가한 호르몬 배지로 하여 비교하였다. 기본배지에는 3% sucrose(w/v) 와 0.1%(w/v) 활성탄을 첨가하였다. pH를 5.8로 조절한 후 agar를 0.8%(w/v) 첨가하고 전자랜지를 이용하여 agar 를 완전히 용해시켰다. Agar가 완전히 용해된 배지는 페 트리디쉬(100 × 40mm)에 50mL씩 분주하고 고압멸균기를 이용하여 121℃에서 15분간 소독하였다.
구경 절편체의 치상 방법을 달리하기 위하여 구경을 횡 으로 3-4mm 두께로 절단하여 상부가 위로 가도록 치상 한 처리구(정상치상)와 절편체를 뒤집어서 하부가 위로 가 도록 치상한 처리구(역위치상)를 두었다. 치상이 끝난 페 트리디쉬는 23℃의 배양실에서 암막을 이용하여 5주간 암 배양 한 후, 암막을 걷어주어 광도 60μmol • m−2 • s−1, 광주 기 16시간의 광환경으로 옮겨 주었다. 치상 후 10주째에 절편체에서 발생된 캘루스와 부정아를 나누어 계대배양하 였다. 호르몬이 없는 기본배지 처리구는 호르몬 없는 MS 배지에, 호르몬 배지의 것은 1.0mg • L−1BA + 0.5mg • L−1 IAA가 첨가된 MS배지로 계대배양하였다.
생육조사
치상 개시 후 10주째에는 부정아 발생 정도와 뿌리수 를 조사하였다. 부정아 발생정도는 0단계부터 5단계까지 6 수준으로 구분하여 조사하였다. 절편체의 절단면에 부정 아가 전혀 보이지 않을 때는 0, 절단면에 부정아 조직 크 기가 직경 1 ~ 2mm 일때는 1, 부정아 조직 크기가 직경 3 ~ 4mm 정도일 때는 2, 5 ~ 6mm 크기일 때는 3, 7 ~ 8mm 일 때는 4, 절단면 전면에 부정아가 발생하였을 때는 5로 간주하였다. 19주째에는 신초수와 신초의 초장, 생체중, 건 물중 등을 조사하여 처리간 차이를 비교분석하였다.
실험설계 및 통계처리
모든 처리구는 패트리디쉬당 3개의 절편체를 이용하였 으며, 각 패트리디쉬를 1반복으로 보고 각각 5반복 처리를 하였다. 이렇게 얻어진 데이터들은 SAS(Statistical Analysis System, V. 9.1, Cary, NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 ANOVA 검정과 Duncan’s multiple range test를 이용하여 실험군 평균값을 유의수준 5%에서 유의성을 검정하였다.
결 과
프리지아 ‘Shiny Gold’와 ‘Gold Rich’ 구경 절편체를 호르몬 유무, 치상방법을 달리하여 치상하고 암배양이 끝 난 5주째에 그 결과를 육안으로 관찰하였다. 호르몬 유 무와 관계없이 프리지아 구경 절편체를 역위치상했을 때 정상 치상한 처리구보다 노란색의 부정아와 뿌리가 훨씬 많이 관찰되었다(데이터 생략). 암상태에 있던 절편체들 을 광상태의 배양실로 옮기고 5주 후 1차 생육조사를 실 시한 결과, 암상태에서는 노란색이었던 부정아는 광상태 로 이동 후 녹색으로 변화되었으며 일부는 이미 신초로 성장하기 시작하였다(Fig. 1). 프리지아 ‘Shiny Gold’와 ‘Gold Rich’ 두 품종 모두 호르몬 유무에 따른 부정아 발생 정도에는 차이가 없었다. 그러나 절편체 치상을 정 상으로, 또는 거꾸로 역위치상을 하는 치상방법에 따라 서는 신초 발생정도와 뿌리수에서 높은 유의성을 나타내 었다(Table 1, Table 2). 호르몬이 없는 기본배지에서 부정아 발생 정도를 살펴보면 역위치상했을 때 ‘Shiny Gold’는 3.2개, ‘Gold Rich’는 4.3개로 정상치상했을 때의 약 2~6배 높은 결과를 보였다. 또한 ‘Gold Rich’ 품종이 ‘Shiny Gold’ 품종보다 부정아 발생과 뿌리수가 더 많은 것으로 나타나 품종간 차이를 보였다. 그리고 호르몬처리 에 따른 차이는 5.0mg • L−1 NAA + 5.0mg • L−1 Kinetin이 첨가된 배지에서 배양된 절편체가 기본배지에서 보다 뿌 리수가 더 많이 관찰되었다.
처음 치상하고 19주가 지났을 때, 부정아에서 발달된 신초와 뿌리의 최종 생육을 조사하였다. 그 결과 ‘Shiny Gold’와 ‘Gold Rich’ 두 품종 모두 역위치상 했을 때, 호 르몬 유무와 상관없이 신초수가 매우 높게 나타났다(Fig. 2, 3). ‘Shiny Gold’ 절편체를 역위치상 하였을 때, 호르 몬 없는 MS배지에서 신초수가 절편체당 42.7개로 정상치 상에 비해 약 2.5배 증가되었고, 호르몬 첨가배지에서는 17.7개로 정상치상 처리구에 비해 약 7.1배 증가되었다. ‘Gold Rich’를 역위치상 하였을 때, 기본배지에서는 신 초수가 절편체당 55.4개로 정상치상에 비해 약 1.7배 증 가되었고, 호르몬 첨가배지에서는 61.0개로 정상치상에 비 해 약 2.4배 증가되었다. 호르몬 첨가가 신초 발생에 미 치는 영향에 대해서는 품종에 따라 차이가 있는 것으로 나타났다. ‘Shiny Gold’에서는 호르몬이 없을 때 호르몬 첨가 시보다 신초발생이 좋았으나, ‘Gold Rich’에서는 차 이가 보이지 않았다. 신초의 초장과 최대 근장의 경우 ‘Shiny Gold’와 ‘Gold Rich’ 두 품종 모두 식물호르몬이 첨가된 배지에서 정상치상했을 때 높은 경향을 보였다. 이는 신초수 발생정도와는 반대되는 결과로, 신초수가 적 을수록 신초의 생육은 상대적으로 좋았기 때문인 것으로 여겨진다. 생체중과 건물중의 변화는 ‘Shiny Gold’의 경 우 기본배지에 역위치상한 경우 생체중과 건물중이 유의 적으로 높게 나타났다(Table 3). 그에 반해 ‘Gold Rich’ 는 생체중에서는 차이가 없고 건물중은 호르몬 없는 배 지에 정상치상했을 때, 다른 처리구보다 유의적으로 낮 았다(Table 4).
고 찰
본 실험에서는 프리지아 구경을 횡으로 상중하 3부위 로 절단하여 배지위에 정상으로 또는 상하를 거꾸로 뒤 집어 치상하였다. 치상 후 5주간 암상태로 배양한 결과, 황색의 많은 부정아와 캘루스를 관찰할 수 있었다. 프리 지아 구경 조직배양시 배양초기에 일정기간 암배양이 요 구되며 기관분화는 광을 조사한 이후에 가능하다는 기존 결과(Kim et al. 1997; Stimart and Ascher 1982)와 같 은 결과를 관찰할 수 있었다. 광조건으로 옮기자 황색의 캘루스와 부정아들은 곧 녹색을 띄기 시작했으며, 부정 아와 신초가 신장하기 시작하였다(Fig. 1). 특히 절편체 를 역위치상했을 때는 정상치상했을 때보다 2.5배에서 7 배에 가깝게 많은 부정아 및 신초가 발생하였다(Fig. 3). 치상 19주 후에 1개의 절편체로부터 ‘Shiny Gold’는 40 개 이상의 신초를, ‘Gold Rich’의 경우는 60개 이상의 신초를 얻을 수 있었다. 이러한 결과는 지금까지 발표되 었던 프리지아 기내 급속대량증식에 관한 어떤 결과보다 도 효율적인 결과로 보인다. 부정아나 캘루스가 발생하 는 부위에 관해서는 정상치상의 경우에는 구경 표피에 있 는 액아로부터 많이 발생하였으나, 역위치상한 경우에는 절단면 전면으로부터 부정아와 캘루스가 발생하는 것을 관찰 할 수 있었다. 지금까지 구근류의 조직배양시 구근 을 횡으로 절단하여 상하를 반대로 치상한 연구결과가 보 고된 바 없다. 그렇기 때문에 어떤 기작에 의해 이런 결 과가 나왔는지 아직까지는 분명하게 설명하는데는 무리 가 있다. 다만 몇 종류의 식물에서 삽수를 정상으로 치 상하는 것 보다 수평이나 거꾸로 치상했을 때, 더 많은 신초가 발생하였다는 보고는 있다. 나리에서는 소화경을 조직배양할 때, 꽃받침에서 가까울수록 그리고 배지에 역 위치상했을 때, 정상치상보다 약 5배 정도 더 많은 부 정아를 발생시켰다는 보고(Liu and Burger 1986)가 있다. Orlikowska et al.(2000)은 크로톤(Codiaeum variegatum) 절편체를 역위치상했을 때, 그렇지 않은 경우보다 부정아 가 많이 발생하였다고 하였고 그 원인에 대해서는 오옥 신의 이동이 저해되었기 때문이라고 해석하였다. Kumar et al.(2005)은 고추(Capsicum annuum)의 하배축을 배지 에 역위치상했을 때에만 다수의 부정아를 얻을 수 있었 으며, 그 주된 원인으로는 극성이 관여하는 것 같다고 고 찰하였다. 본 연구 결과도 구경의 절편을 역위치상했을 때 정상치상보다 훨씬 많은 수의 부정아를 얻었지만 이 러한 현상이 선행 연구결과들과 같이 오옥신의 이동이나 극성과 관련이 있다고 판단하기는 곤란하며 금후 이에 대 한 좀더 세밀한 연구가 필요하다.
그 동안 프리지아의 조직배양에 관한 연구로는 생장점 배양에 의한 무병주 생산에 관한 연구가 많이 있었고 (Bertaccini et al. 1989; Foxe 1993; Kim et al. 2013; Ko et al. 2003; Song 1998), 구경을 이용한 기내 대량증식 에 관한 연구도 있었다(Bajaj and Pierik 1974). 하지만, 구 경을 횡으로 잘라 절편을 역위치상했을 때, 부정아와 신 초 발생이 획기적으로 증가한다는 것은 본 논문이 최초 일 것이다. 결론적으로 프리지아를 기내에서 급속대량증 식을 하고자 할 때는 구경을 횡으로 절단하여 상하를 반 대로 뒤집어서 치상하는 것이 부정아 발생과 신초 발생 에서 가장 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 판단된다.
