서 언

나도풍란은 대부분이 한국, 중국, 일본에 분포하며 우 리나라에는 제주도의 해발 150m에 위치한 비자림과 전 라남도 및 남해도서의 상록수림과 침엽수림의 나무나 바 위에 착생하는 난이다. 뿌리가 잘 발달되었으며 짧은 줄 기에 2 ~ 5개 잎이 좌우 2줄로 호생한다. 잎은 길이 7 ~ 10cm, 폭 1.5 ~ 2.5cm로 장타원이며 엽육이 두껍다. 꽃은 담록색 바탕에 적색 무늬가 있으며 5 ~ 15cm의 화 경에 4 ~ 10개의 꽃이 20 ~ 30일 동안 개화한다. 일반적 으로 시중에 유통되는 난과 식물들은 향기가 없는 품종 이 대부분이며 향기가 나는 품종을 개발하는 것은 산업 적으로 매우 중요한 육종 목표이다(Kim et al. 1979). 나 도풍란의 경우는 그윽한 향기가 매혹적으로 풍긴다고 해 서 계란(桂蘭)이라 불리었으며 다른 난과 식물들과 비교 해 향이 강하고 산업적으로 활용하기에 좋은 품종이라 할 수 있다(Hur 2006).

일반적인 꽃의 향기성분은 크게 3가지로 분류되는데 terpenoid, benzenoid, fatty acid derivatives가 그것이다 (Pichersky et al. 1994). 시중에서 가장 쉽게 접할수 있 는 장미의 경우에는 알려진 향기성분만 400종 이상이 되 고 품종별로 주요 성분과 조성 비율이 다르다고 알려져 있다(Giulia et al. 2006). 나도풍란과 잎모양이 유사한 착 생란 종류인 Phalaenopsis(P.)에서는 향기가 나는 품종은 드물지만 원종 중에서 향기를 지닌 종류가 있는데 P. bellina, P. violacea, P. schilleriana 등이 그것이다. 이중 P. bellina의 꽃을 이용하여 향기분석한 결과 주요성분이 linalool과 geraniol인 것으로 보고 되었다(Park 2011). 이 는 Hsiao 등이 분석한 GC-MS 결과와 유사한 것으로 난 과 식물에서 분석된 주요향기성분인 linalool이 가장 많 은 비율로 포함되어 있음을 알 수 있다(Hsiao et al. 2008). 이 향기성분을 이용하여 대만에서 Bellina라는 향 수가 재조된 바 있다.

GC/MS와 전자코기기를 이용하여 호접란과 나도풍란의 향기성분을 분석한 결과 나도풍란에서는 linalool, geraniol, citronellol, benzoic acid가 주요 향기성분인 것으로 보고 되었다(Been et al. 2013).

화기조직별 향기발현정도를 분석한 결과 Phalaenopsis에 서는 petal과 lip에서 발현이 강하게 나타나고 sepal과 column에서는 상대적으로 발현량이 적은 것으로 보고되었 다(Park 2011). P. bellina에서 향기발현 유전자(PBGDPS) 의 화기조직별 발현량상을 살펴본 결과에서 petal, sepal, lip에서 유전자 발현이 강하게 나타났다(Hsiao et al. 2008). 나리의 경우에는 품종마다 차이를 보였지만 주로 perianth 에서 향기 발현량이 높게 나타나는 것을 확인하였다(Kim 2007).

생체리듬과 광주기성이 식물생리 작용에 영향을 끼치며 circadian rhythm은 환경요소인 빛과 어둠, 온도와 밀접한 관 련이 있는 것으로 보고 되었다(Johnson, 1998). Circadian rhythm과 관련된 연구는 gene expression, cytosolic calcium levels, protein phosphorylation, chloroplast movement, stomatal opening, hypocotyl length, cotyledon and leaf movement, petal opening, flowering 등 다양한 연구가 진행 되었다(McClung 2000). 하지만 circadian rhythm과 광주기 성이 향기발현량과 패턴에 미치는 영향에 대해서는 연구 가 거의 이루어지지 않았다.

본 실험에서는 나도풍란 꽃에서 발현되는 주요 향기성 분을 분석하고 나도풍란 군집에서 개체간 향기발현량과 발현패턴양상을 비교 분석하였다. 또한 꽃의 발달단계와 꽃의 기관조직별 향기발현량을 분석하였으며 광조사시간 과 생체리듬주기에 따른 향기발현량과 발현패턴을 분석 하고자 하였다.

재료 및 방법

식물재료

나도풍란(Sedirea japonica)은 AE4009~54, AE5000 ~ 5129 개체들은 거제시 농업기술센터와 나도풍란 육종농장에서 재 배된 나도풍란 123개체를 수집하여 꽃의 개화기인 4-5월 에 개화된 총 20개체를 향기분석 실험에 사용하였다.

GC/MS에 의한 향기성분 분석

나도풍란 향기포집은 Solid-phase micro extraction (SPME)방법을 사용하였으며 agitator의 온도를 5℃를 유 지하고 10분 동안 포집한 후 10분 동안 fiber(DVB-CARPDMS) 에 흡착시키고 1분 동안 탈착시켰다. Injector 온도 는 230℃로 하고 carrier gas는 He으로 1분에 1mL의 속 도로 흐르게 하였다. Column은 DB-5(DB-5MS, 30m × 0.25mm i.d., 0.25μm film thickness, Agilent, USA)를 사용하였으며 electron impactionization voltage는 70eV로 하였다. 향기성분 분석은 Xcalibur software system으로 이루어지고 분석은 NIST(National Institute of Standards and Technology)와 Wiley library를 적용하여 search하였 으며 향기성분 함량은 GC peak area를 %로 표기하였다.

전자코 분석

향기패턴 분석은 전자코 기기 GC/SAW electronic nose system(M7100)을 이용하였고 사용된 column은 DB-5(DB- 5, 1m × 0.25mm i.d., 0.25μm film thickness, Agilent, USA)였다. 향기분석에 사용된 시료는 모두 개화한 신선 한 꽃잎을 사용하였고 각각의 시료는 50mL 시료병에 담 아 뚜껑을 완전히 밀봉한 후 15분정도 실온에 두어 향 을 포집하였다.

전자코의 분석 조건은 데이터 수집 기간은 60초, 가열 에 의해 이루어지는 센서에 흡착한 이물질 제거시간은 30 초, 신선한 공기에 의한 충진 시간(purging time)은 0.5 초, 센서의 안정화를 위한 시간(tunning time)은 30초, 신 선한 공기에 센서를 노출시켰을 때의 분석시간은 30초, 센 서가 시료향과 반응시의 분석시간은 50초로 하였고, oven temperature은 32℃에서 150℃까지 설정하였고 carrier gas 는 He로 하였다. 센서에 흡착되었을 가능성이 있는 이 물질과 시료 측정 후 튜브에 잔류하는 향의 제거를 위 해 air pump를 사용한 시간(sensor auto bake time)은 20초로 하였고 전자코를 측정하여 저항비율값이 0.90 이 상될 때까지 세척하였다. 또한, 시료 채취 방법은 향기 를 센서 표면까지 펌핑하는 dynamic head space 방법을 취하였다.

나도풍란의 향기발현 패턴분석

-개체간 향기분석

나도풍란 개체간의 향기분석은 2013년에서 2015년에 수 집된 개체들을 사용하였다. 수집된 다양한 개체들 중에 서 상대적으로 꽃의 향기가 강하거나 약하다고 판단되는 개체를 임의로 9개 선발하고 선발된 개체들은 비닐봉지 (Clean Zipper Bag, 18 × 20cm, CLEANWRAP, Korea) 를 사용하여 화서 전체를 밀봉한 뒤 15분 이상 향기를 포집하여 전자코 기기를 사용해 분석하였다.

-개화 단계별 향기분석

개화 단계별 향기분석에 사용된 개체들은 화서전체를 기 준으로 나도풍란 기부에서 시작되는 첫번째 꽃을 F1(flower no. 1)으로 표기하고 화경이 끝나는 바깥쪽 부분의 꽃까 지 순서를 차례로 정한 후 전자코 장비를 사용해 향기 분석을 진행하였다. 나도풍란의 기부에 가까이 자리잡은 꽃은 개화가 완전히 진행된 상태였으며 기부에서 바깥쪽 끝으로 순서가 진행될수록 꽃은 미개화 상태이며 꽃봉오 리 형태 혹은 미개화 꽃봉오리였다(Fig. 1A).

-꽃의 소기관별 향기분석

꽃의 소기관별 향기분석은 나도풍란의 기부로부터 4 ~ 5 번째 꽃을 선택하여 먼저 꽃의 전체를 향기 분석한 후 Fig. 1B와 같이 꽃의 소기관별로 꽃받침(sepal), 꽃잎(petal), 입 술꽃잎(lip), 꽃술대(column) 및 거(spur)로 각각 분리해 50ml vial tube에서 15분 이상 향기포집 후 전자코 장비 를 사용해 향기분석 하였다. 특히 spur의 경우 반으로 절 단하여 filter paper를 사용해 꿀샘의 증발을 좀더 원활 하게 유도한 뒤 향기포집용 포집병에 넣고 15분 이상 포 집 후 향기분석을 실시하였다.

-시간대별 향기발현 양상분석

하루 중 시간대별 나도풍란 꽃의 향기성분 변화양상을 알아보기 위해서 12개체를 대상으로 향기포집은 화서전 체를 이용하였으며 포집방법은 개체간 비교측정에 사용 하였던 포집방법을 그대로 적용하였다. 오전 9시를 시작 으로 10시, 11시, 13시, 15시, 17시, 20시, 23시에 시간 대별로 전자코 장비를 사용해 향기 분석을 실시하였다. 광조사와 암처리가 향기발현량상에 미치는 영향을 알아 보기 위해 암처리 16시간, 40시간, 64시간마다 향기발현 량과 패턴을 측정하였으며, 연속적인 광처리를 위하여 LED 식물공장에서 300μmol • m⁻² • s⁻¹ 광량으로 40시간 처리 후 저녁 8시에 전자코를 이용해 향기발현량과 향 기발현패턴을 분석하였다.

결과 및 고찰

나도풍란 개체별 전자코 향기패턴 분석과 GC/MS 분석

나도풍란 개체별 향기발현량과 향기발현패턴을 알아보 기 위해 관능적 평가로 향기가 강하거나 약한 각기 다 른 9개의 개체를 선발하여 전자코를 이용한 향기발현량 과 발현패턴 분석을 하였다. 나도풍란의 꽃을 이용하여 전자코 chromatogram pattern과 polar derivative pattern 을 분석한 결과 retention time 3.2초, 4.2초, 5.4초, 5.8 초, 6.3초, 6.9초, 7.5초, 8.4초, 10.4초에서 9개의 강한 chromatogram peak가 나타났다(Fig. 2A). 이 peak들은 9 개의 개체들에서 공통적으로 나타났으며 다만 발현량에 서는 개체간에 차이가 있는 것으로 나타났다. 그리고 GC/ MS 분석결과에서는 13개의 강한 chromatogram peak가 나타났다(Fig. 2B). 이들 peak에 해당하는 향기성분을 알 아내기 위하여 전자코의 chromatogram peak와 GC/MS chromatogram peak를 비교분석하고 chemical library를 이 용하여 나도풍란의 주요향기성분을 추정하였다. 라일락꽃을 이용한 향기분석에서 같은 종류의 column을 사용했을 경우 전자코 분석과 GC/MS분석에서 얻은 chromatogram peak가 정확하게 일치하는 것으로 보고된 바 있다(Oh et al. 2008). 본 실험에서는 전자코 chromatogram peak와 GC/MS 에서 얻은 chromatogram peak의 위치와 크기에서 완전한 일치를 나타내지 않았는데 이는 전자코와 GC/MS기기에 사용한 column의 길이 차이에 기인한 것이 아닌가 사료 되었다. 두 chromatogram에서 공통적으로 나타나는 peak 를 중심으로 나도풍란의 주요향기성분으로 추정되는 6개 의 peak를 선발하였다. GC/MS 분석 후 chemical library 를 통해서 6가지 peak에 해당하는 향기성분을 추정한바 전 자코에서의 retention time 3.2초 peak는 2-furanmethanol, 4.2초 peak는 linalool, 5.4초 peak는 citronellol, 5.8초 peak는 neral, 6.3초 peak는 nerolidol, 6.9초 peak는 benzoic acid 성분일 것으로 판단하였다(Table 1). 이미 보 고된 나도풍란의 향기성분분석 자료에서도 이들 6가지 성 분이 나도풍란의 향기발현에 중요한 성분으로 추정된다고 하였다(Been 2013).

개체간에서 공통적으로 가장 많은 양을 나타낸 peak는 retention time 5.4초 peak였으며 그 다음으로 많은 발현량 을 나타내는 peak는 4.2초 peak와 5.8초 peak, 6.9 peak 였다. 그리고 3.2초대의 peak와 6.3초대의 peak는 약하 게 나타났다. 선발된 개체들 중에서 발현량을 나타내는 peak가 가장 크게 나타난 개체는 AE5128이었고 반대로 가장 적은 양의 향기발현을 나타낸 개체는 AE5122개체 였다(Fig. 3). 4.2 peak가 가장 많이 발현되는 개체는 AE5116이었으며, 이 개체는 retention time 5.8초 peak와 6.9초 peak가 타 개체들에 비해 발현량이 높은 것으로 나 타났다. 그리고 관능평가시 강한향기를 보였던 개체들과 약한향기를 보였던 개체들을 전자코분석 결과로 확인하 였을 때 강한향기를 보였던 개체들이 약한향기를 보였던 개체들보다 높은 향기발현량을 보여주었다. 나도풍란 군 집에서 개체별로 향기발현량과 향기패턴을 비교분석한 결 과 주요성분으로 예측되는 6개 peak는 모든 개체에서 발 현되는 것으로 나타났지만 개체간 향기발현에 관여하는 peak의 발현량에 차이가 있는 것으로 나타났다.

꽃의 발달 단계별 향기발현분석

나도풍란은 총상화서이며 Fig. 1A에서 보듯이 화경의 기저부에 꽃은 개화가 상당히 진행된 꽃이며 화서끝으로 갈수록 개화가 덜된 미개화 상태나 봉오리 상태를 나타 낸다. 화서의 기부에 위치하는 노화중인 첫꽃을 F1으로 끝부분의 꽃봉오리 상태를 F11로 차례로 번호를 부여하 였고 각각의 꽃을 따서 향기발현량과 향기발현패턴 분석 을 실시하였다. 총 9개체의 화서를 분석하였으며 F1(flower no.1)에서 F8(flower no.8)까지 꽃에서는 향기성분들이 증 가하는 패턴을 보였지만 F9단계에서 서서히 줄어들다가 꽃봉오리 상태인 F11단계에서는 향기성분의 발현이 거의 미미하였다(Fig. 4).

6.9초대 peak의 경우는 개화가 100% 진행된 F4~F8 꽃 에서 발현량이 가장 많은 것으로 나타났다. 그리고 두번 째로 많이 발현되는 5.8초 peak의 경우 약간의 편차는 있었지만 F6 ~ F8 사이에서 가장 많은 발현량을 보여주 었다. 5.4초 peak의 경우 화서의 중앙부인 F6에서 가장 높은 발현량을 보였으며 중앙부분에서 양쪽 끝부분으로 갈수록 발현량이 줄어드는 패턴을 보여 주었다. 4.2초 peak의 경우는 꽃의 피는 순서와 관계없이 완전히 개화 된 꽃에서는 비슷한 양을 보여주었지만 완전히 개화하지 않고 일부만 개화된 꽃봉오리 형태(F10, F11)에서는 완 전히 개화된 꽃보다 낮은 발현량을 나타냈다. 그리고 3.2 초와 6.3초 peak의 경우에는 개화상태와 관계없이 발현 량이 적은 것으로 나타났다. 이를 통해서 나도풍란의 향 기성분은 꽃이 완전 개화한 중앙부분에서 가장 많은 양 의 향기가 발생되는 것을 확인할 수 있었으며 꽃의 상 태가 노화단계로 갈수록 5.4초와 5.8초 peak들의 발현이 줄 어들었으며 개화직전의 상태에서는 4.2초, 5.4초, 5.8초, 6.9 초 peak들의 크기가 상대적으로 작았다. 각각의 향기성 분 발현량은 꽃의 발달 단계별로 차이가 있었으며 이것 은 특정 향기성분의 추출시 고려해야할 사항이라고 판단 된다. 꽃의 개화정도에 따른 향기분석은 장미, 나리 등 에서 이루어진바 있다. 장미의 경우 개화정도를 5단계로 나누어 분석했는데 분석된 개체 모두 만개상태인 4단계 에서 총 향기성분의 함량이 가장 많았으며 개화 1단계 와 5단계의 총 향기성분은 다른 단계보다 적은 함량을 보였다(Lee 2008). 나리의 향기분석에서도 개화단계중 만 개 때 향기함량이 가장 많았고 꽃잎의 노화과정이 진행 되면서 함량이 감소하는 결과를 보였다(Kim 2007). 이 러한 결과들은 본 연구결과와도 일치함을 보여주었다.

꽃의 기관별 향기분석

꽃의 소기관별 향기발현량과 향기발현패턴을 분석하 기 위해 꽃 전체와 분리된 소기관들을 측면꽃받침(lateral sepal 2ps), 상편꽃받침(dosal sepal 1ps), 꽃받침(sepal 3ps), 꽃잎(petal 2ps), 립과 거(lip, spur), 꽃잎과 립(petal, lip 3ps), 꽃술대(column 1ps)를 50ml vial에 담아 15분간 향기포집 후 측정하였다. 꽃의 소기관중 sepal과 petal부 분에서 주요 6가지 chromatogram peak가 다른 소기관 조 직에 비해서 훨씬 더 크게 나타남을 보였다(Fig. 5). Sepal 과 petal을 비교하였을 때 sepal 부분에서는 retention time 5.4초 peak, 5.8초 peak, 6.9초 peak가 더 높게 측정되었 으며 petal 부분에서는 retention time 3.2초 peak, 4.2초 peak, 6.3초 peak가 더 높은 것을 확인하였다. 하지만 꿀 샘이 들어있는 spur와 column 및 ovary에서는 주요 6가 지 peak가 sepal, petal과 비교하여 매우 약하게 나타 났다. 그리고 spur조직을 반으로 잘라 filter paper에 묻 혀서 향기포집을 유리하게 해주어 향기측정을 해보았을 때도 자르지 않은 spur조직의 chromatogram peak와 유 사하게 매우 낮은 peak를 보여주었다. 이 결과를 통해서 나도풍란 꽃의 주요향기성분은 주로 sepal과 petal조직에 서 대량으로 발생되는 것으로 판단되었다. 그리고 꿀샘 이 들어있는 spur에서는 곤충을 유인하기 위해 향기성분 발현이 많을 것으로 추정하였지만 spur에서는 향기성분 발현이 약한 것으로 나타났다. 호접란에서 조직별로 향 기발현량을 분석한 연구에서는 sepal, petal, column에서 는 모두 고루 향기성분이 발현된다는 보고가 있었다(Been 2010). 이는 본 연구결과와 다소 상이한 것으로 추정되 지만 난초의 난향기를 발현하는 주된 꽃의 소기관은 petal 과 sepal로 판단되었다. 그리고 장미의 향기는 꽃의 기 관 중 꽃잎의 원추형 유두돌기(conical-papillate) 모양을 가지고 있는 향축면 표피세포(adxial epidermis)에서 생성 되는 것으로 알려져 왔다(Stubbs and Francis, 1971; Scalliet et al. 2006). 그러므로 앞으로 나도풍란의 sepal 과 petal에서도 향기의 발산부위를 알기 위해 세포학적 연 구가 더 필요할 것으로 보인다.

생체리듬주기변화와 광조사에 따른 향기발현 패턴분석

하루 중 시간대별로 나도풍란 꽃에서 향기성분의 발현 변화양상을 알아보기 위해서 오전 9시를 기점으로 약 2 시간 간격으로 23시까지 전자코를 이용하여 향기패턴분 석을 하였다. 전자코 분석에 사용된 AE5109, AE5120, AE5123, AE5126, AE5011개체에서 시간에 따른 주요 6 가지 향기성분의 평균적인 발현량 변화를 확인하기 위해 서 개체마다 분석된 각각의 주요향기성분 발현량의 값을 더해 평균을 구하여 그래프로 나타내었다(Fig. 6). 그 결 과 전체적인 경향은 retention time 5.4초 peak의 경우 오전 9시를 시작으로 10시경에 가장 높은 발현량을 보였 으며 11시 이후로 줄어들어서 20시 이후에는 거의 나타 나지 않았다. 두번째로 높게 나타난 peak는 retention time 4.2초 peak로 9시부터 증가하기 시작하여 11시에 가장 많 은 양이 발현되었다가 이후 계속 줄어들어 20시 이후에 는 거의 나타나지 않았다. Retention time 6.9초 peak의 경우에도 10시에 가장 높은 발현량을 나타내었으며 이후 계속 줄어 20시에는 발현량이 미미하게 나타났다. 하지 만 3.2초 peak와 6.3초 peak의 경우 9시부터 15시까지 양의 큰 변화가 없다가 이후 서서히 줄어들어 23시에는 peak가 소량만이 발현되는 것으로 나타났다. 개체마다 조 금씩의 차이는 있었지만 평균적으로 11시에 가장 많은 양 의 향기성분들이 발생되는 것으로 추정되었으며 17시 이 후에는 발현량이 눈에 띄게 줄어 20시 이후에는 향기성 분의 발현량이 미미한 것으로 나타났다. 이상의 결과에 서 빛이 있는 낮에는 향기발현이 강하게 되었으나 빛이 없는 밤에는 향기발현이 없거나 미미하였으므로 빛이 향 기발현에 영향을 주는 주요요인 인것으로 판단되었다. 그 러므로 암처리와 광조사처리를 비교하여 광조사와 생체 리듬주기가 향기발현 양상에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. 암처리 16시간 후 전자코로 향기패턴분석을 한 결과 자연빛에 노출된 정상적인 개체(Fig. 7A)와 비교해 서 6.9초 peak가 크게 증가하였으며 5.4초 peak를 포함한 주요 peak 5개는 대조군과 비교해 큰 변화가 없었다. 암 처리 40시간 처리구는 16시간 암처리구 보다 급격하게 향기발현이 낮아지는 패턴을 보였으나 Fig. 7C에서 보는 바와 같이 5.4초 peak는 급격히 증가한 양상을 보여주 었다. 암처리 60시간 처리구에서는 Fig. 7A, 7C, 7D에 서 보듯이 대부분의 향기성분 발현이 줄어드는 경향을 보였으나 5.4초와 6.9초 peak는 급격하게 증가하는 양상 을 나타냈다(Fig. 7B). 이처럼 암처리 결과에서는 대체로 암처리가 경과될수록 주요 peak발현이 줄어들었으나 일 부 peak는 오히려 증가하였다. 암처리후 향기성분발현 양 상이 개체마다 다소 차이를 보였으며 이런 차이는 개체 간 유전적 차이에 기인하며 나도풍란 개체의 생체리듬과 관련이 있으리라 판단된다. 보통 호접란의 경우에도 흐 린날이나 비가 오는 날씨의 경우 유향성 호접란에서도 향 기발현이 없거나 미미하다는 보고한바 있으며 이는 빛조 건이 향기발현에 큰 영향을 미치는 요소라는 본 연구결 과와도 일치하는 내용이다(Been 2003). 온실에서 자연광 을 받으며 일반적인 환경에서 자라는 나도풍란 개체는 오 전 10시와 저녁 8시에 각각 전자코 분석을 했을 때 Fig. 8A와 같이 오전 10시에는 중요향기성분의 발현이 강하 게 나타나고 저녁 8시에는 향기발현이 거의 나타나지 않 았다. 하지만 식물공장에서 40시간 이상 계속해서 광조 사를 한 후 저녁 8시경 전자코 향기패턴 분석을 했을 때 는 Fig. 8A에서 저녁 8시에 향기성분이 나타나지 않았 던 결과와 다르게 Fig. 8B에서 보듯이 분석에 사용된 개 체모두 낮 시간대에 나타나는 주요 peak들이 강하게 나 타났다. 이는 절대광조사량의 축적으로 인한 생리적 반 응의 결과로 판단되었다. 즉 광이 충분히 포화된 상태에 서는 향기발현량이 계속 지속되어지거나 과도한 광조사 는 생체리듬 주기변화를 뛰어 넘어 작용하는 것으로 생 각되었다. 일반적으로 생체리듬은 식물생리적으로 기억되 어 환경에 대한 적응 및 반응을 하는 것으로 추정되지 만 과도한 광조사 시간이 생체리듬을 와해시키기도 한다 고 판단된다. 향후 생체리듬과 광조사 그리고 향기발현 에 있어서 광주기성에 일차적 광수용체인 phytochrom의 작용기작에 관한 해석은 보다 심도있는 연구를 통하여 밝 혀져야 한다.