서 언
심비디움은 국내 난 전체 재배면적 227ha의 약 45% 인 103ha정도, 생산액 295억으로 난 품목 중 재배규모 가 가장 크며(MIFAFF 2010), 수출 화훼산업을 주도하는 품목으로 주목받고 있다. 주로 중국 수출용으로 재배하 고 있으며, 수출은 2000년대 초반부터 현재까지 개화주 재배분 형태로 년간 약 40만분 정도의 수출량을 유지 하며, 전체 난 수출액 20,264천$(MIFAFF 2010)의 약 92%인 약 19,000천$ 정도를 수출하고 있다. 주요수출 대 상국인 중국은 꽃 크기가 큰 대형종을 선호하고, 특히 황 색과 적색위주의 화색을 좋아하며 주로 구정명절(중국 춘 절)에 선물용으로 구매한다. 심비디움 수출 농가들은 수 출단가가 내수가격 보다 약 2배 이상 높은 수출국 기호 에 따라 중• 대형의 적색 혹은 황색 위주의 품종을 선 호하고 있다. 심비디움은 세계적으로 약 52개의 원종이 자생하고 있으며(Du Puy and Cribb 2007), 우리나라에 서 심비디움 품종개발은 수입대체 및 수출국 기호성 우 수 품종 개발을 목표로 1992년도에 착수하여 현재까지 25품종이 국립종자원에 품종보호 출원되었으며 2003년에 국내 최초 품종인 ‘뷰티프린세스’ 등 4품종을 개발한 이 후 매년 3품종 이상 신품종을 개발하고 있다. 현재까지 품종보호등록이 완료된 품종은 ‘오렌지볼’ 등 34품종이며 (Kim et al. 2011) 일부 품종은 종묘생산업체에 기술을 이전하여 본격적으로 종묘를 대량생산하고 일부 농가에 종묘가 보급되는 초기단계라고 할 수 있다.
현재 심비디움 재배농가에서는 대부분의 종묘를 수입 하여 사용하고 있고, 수입 종묘비는 1본당 약 2,000원대 로 농가경영비의 약 20% 정도를 차지할 만큼 비중이 높다. 그렇지만 국산 품종의 종묘는 약 1000원대로 공 급이 가능해 수출 농가의 경영비 절감 및 수출경쟁력 향 상, 그리고 수입국가와의 종묘가격 협상력 확보 등의 효 과를 기대할 수 있어 국제 경쟁력 있는 국산 품종의 개 발이 중요하다.Fig. 1
최근 급속도로 발달한 생명공학 기술 개발에 힘입어 식 물 유전자원의 분류 및 육종 등에 활용 가능한 다양한 분자생물학적 분석기법 개발을 위하여 단백질, DNA 마 커 등이 유용하게 활용되어 왔다. 특히 DNA 마커는 형 태적인 특성 및 단백질 마커에 비하여 활용할 수 있는 마커의 수가 제한적이지 않고, 재배환경에 영향을 받지 않는 장점이 있어 최근 게놈 프로젝트의 급속한 발전과 더불어 그 연구가 활발히 진행되고 있다. DNA 마커를 이용한 분자생물학 연구는 Mullis et al.(1986)에 의해 특 정한 DNA를 빠른 시간 내에 증폭할 수 있는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 기술이 개발됨 에 따라 급속한 발전을 이루게 되었다. 한편, PCR을 기 반으로 하는 주요한 DNA 마커로는 RAPD(random amplified polymorphic DNA)(Choi et al. 2003, 2006; Goh et al. 2005; Niknejad et al. 2009; Obara-Okeyo and Kako 1998; Park et al. 2010; Williams et al. 1990), SSR(simple sequence repeat)(Huang et al. 2010; Hyun et al. 1999; Park et al. 2013; Trautz and Renz, 1984; Wang et al. 2009), AFLP(amplified fragment length polymorphism)(Chang et al. 2006; Vos et al. 1995), STS(sequence tagged site)(Olsen et al. 1989), CAPS(cleavage amplified polymorphic sequence)(Ok et al. 2004) 등이 있는데, 이러한 분자기법들이 식물의 유 전자원 집단, 품종 및 개체 간의 유전분석에 널리 활용 하여 유전적 다양성을 분석하고 있다. 이중 RAPD 분석 방법은 template DNA의 양이 적게 소요되고, 실험방법 이 편리하며 실험에 소요되는 비용 또한 적어 아직까지 도 다양한 유전분석에 꾸준히 이용되고 있다. 심비디움 속은 특성상 그 분포가 매우 광범위하고 다양하여 다른 식물에 비해 분류에 대한 연구가 미흡한데, 육성 품종을 대상으로 품종구분 및 교배모본 활용을 위한 여러 가지 유전분석 연구가 진행되었지만, 원종과 비교한 분석사례 는 많지 않은 실정이다.
따라서 본 연구는 심비디움 원종 및 주요 품종을 대 상으로 RAPD 분석을 이용하여 이들의 유전적 근연관계 를 비교하고, 또한 유전적 구별성과 균일성을 확인하여 이들 생화학적 표지를 품종식별의 지표로 활용함으로써 교배모본을 선정할 때 품종의 기초자료를 얻기 위하여 수 행하였다.
재료 및 방법
식물재료
본 연구에 사용한 재료는 농촌진흥청 국립원예특작과 학원에서 심비디움 10개 원종 및 20개 품종을 수집하여 이용하였다(Table 1). 심비디움 원종 및 품종은 육종온실 에서 바크에 식재하여 겨울철 15℃ 이상을 유지시키고, 병해충방제 및 기타관리는 난 표준재배법에 준하여 재배 하였다(RDA 2003).
Total DNA 분리 및 정제
심비디움 어린잎을 채취하여 25℃ 암상태에서 1일 경 과 후 total DNA분리에 사용하였다. 어린잎 100mg을 2mL micro-centrifuge tube에 넣고 액체질소와 함께 pestle을 이용하여 분쇄한 다음 DNeasy Plant Mini-kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 Protocol에 따라 DNA 를 추출하였다. 추출한 DNA는 1.2% agarose gel에서 Lambda DNA(Promega)와 함께 전기영동하여 확인하였 고, 순도 및 정량은 Ultrospec III spectrophotometer (Pharmacia Biotech, Roosendaal, The Netherlands)로 정량 한 후 10ng • μL−1의 농도로 희석하여 분석에 이용하였다.
PCR 반응조건 구명
DNA 증폭기로 PTC-200 DNA Engine(Bio-Rad Co., USA)를 사용하여 심비디움 30종의 DNA를 증폭 하였다. PCR 반응조건 구명을 위한 반응액 및 반응조 건은 Table 2와 같이 설정하여 비교하였다. 적정한 반 응조건에서 증폭한 DNA 산물은 1.5% agarose gel(TBE buffer, pH 8.0)에 110volt에서 1시간 30분 전기영동하여 분리하였으며, EtBr(Ethidium Bromide)로 염색한 후 UV transilluminator를 이용하여 증폭된 DNA 단편을 확인하 고 Polaroid film으로 촬영하였다. 실험결과에 대한 재현 성을 위해 2회 반복 실험하여 증폭된 DNA 단편을 확 인하였다.Table 3
RAPD 마커를 이용한 분석
RAPD분석은 Operon Technology Inc. 에서 제작된 10-mer Operon random primer 400개를 이용하여 유전 분석을 수행하였다. PCR에 사용된 혼합용액의 조성 및 PCR 반응은 규명된 조건으로 수행하였다. 증폭된 DNA products는 0.5X TBE buffer를 사용하여 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 UV transilluminator로 유전양상을 확인하였다.
통계분석을 이용한 유연관계 분석
증폭된 PCR 산물의 분석은 band가 있는 것을 “1” 없는 것을 “0” 하여 data matrix를 작성하였으며, 유전적 다양성 및 유전적 거리를 산출하기 위하여 POPGENE shareware, version1.31(Yeh et al. 1997)을 이용하여 분석하였다. 또한 UPGMA(unweighed pair group method using arithmetic averages) 방법으로 dendrogram을 작성하여 유연관계를 비 교 분석하였다.
결과 및 고찰
PCR 반응조건 구명
심비디움의 PCR 반응조건 구명하고자 각각의 반응액 조건을 알아본 결과 PCR tube(0.5mL)에 10ng template DNA, 100ng primer, 200μM dNTP mixture, 1unit Taq DNA polymerase, 1.5mM MgCl2, 10mM Tris-HCl을 첨 가하여 25μL로 조정하여 최적 반응액을 만들었다. PCR 반응 조건은 94℃에서 5분간 예비 변성(Pre-denaturation) 시키고, 94℃에서 3분 변성(Denaturation), 37℃에서 1분 간 primer 접촉(Annealing) 및 72℃에서 5분간 증폭 (Elongation)시키는 과정을 45회 반복하는 것이 가장 효 과적이었고, 반복한 후 72℃에서 10분간 연장한 후 4℃ 에서 반응을 종료하였다. Park et al.(2011)은 심비디움 품 종을 SRAP(sequence-related amplified polymorphism) 마커로 유전적 다양성 분석 및 Kim et al.(2014)은 토종 도라지의 기원 분석 시 DNA 추출을 CTAB법을 변형 하여 사용하였고, 본 실험에서는 상용화되어 편리한 DNA 추출 kit(Qiagen, Germany)을 사용하였다. Park et al. (2011)은 PCR 반응액 조성시 1.0mM MgCl2, 0.32unit Taq DNA polymerase를 사용하였고, PCR 반응조건은 94℃에서 1분, 35℃에서 1분, 72℃에서 1분을 5회 수행 한 후 다시 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분 을 35회 반복 후 72℃에서 10분간 연장하였다. 같은 종 의 식물이라도 DNA 추출방법의 차이에 의해 PCR 증 폭 단계별 조건 및 과정이 다른 것으로 생각되었다.
RAPD 마커를 이용한 유연관계 분석
400개의 RAPD 마커를 사용하여 심비디움 원종 및 품 종을 대상으로 PCR을 수행하여 polymorphism을 나타 내는 OPA13 등 10개의 primer를 선발하였다. 선발된 primer를 이용하여 유전분석을 수행한 결과 증폭된 총 band 수는 87개였고, 증폭된 DNA 단편 크기의 범위는 507,900bp이었다(Table 4). RAPD primer 들을 이용하여 심비디움 원종 및 품종 간에 특이적으로 나타난 DNA banding pattern을 비교해본 결과 Fig. 2.와 같이 특이적 인 유전양상을 확인할 수 있었다. OPF20 primer를 이용 한 유전분석 결과 약 480bp에서 C. lowianum, 2144 및 C. ‘In the mood’ 품종에서 DNA 단편이 관찰되었고, C. ‘Pastel Princess’의 경우 약 3,000bp의 DNA단편이 증폭되지 않았고, 이 품종의 경우 약 350bp의 DNA 단 편만 증폭되어 이 primer로 품종을 구분할 수 있음을 알 수 있었다. OPK04 primer를 이용한 유전분석 결과 약 280bp에서 C. ‘Shoe Girl Husky Honey’와 2113 품종 에서 특이한 DNA단편이 관찰되었고, 이 품종은 DNA band pattern이 단순하여 OPF04 primer로 품종구분이 용 이하여 교배모본으로 활용할 때 F1의 유전분석에 이용할 수 있을 것으로 판단되었다. OPG08 primer를 이용한 유 전분석 결과 약 6,180bp에서 C. Pee Wee, C. lowianum, 2111 및 2118 품종에서 특이한 DNA 단편이 관찰되었으 며, OPL13 primer를 이용한 유전분석 결과 약 7,900bp 및 약 300bp에서 C. simulans 및 C. finlaysonianum 원 종에서 특이한 DNA 단편이 관찰되어 OPL13 primer를 품종 구분 marker로 활용이 가능할 것으로 사료되었다. 15개의 RAPD primer를 이용하여 132개의 밴드를 이용 하여 심비디움 36품종의 유전적 다양성을 보고하였는데 400개 이상의 많은 primer를 이용하여 다형성이 높은 primer만을 선별한 것과 본 연구의 선별법과 일치하였다 (Obara-Okeyo and kako 1998).Fig. 3
선발된 10개의 primer로부터 87개의 밴드(Table 4)로부 터 심비디움 원종 및 품종 30종의 군집분 석을 한 결과, 유사도 0.647을 기준으로 2개의 집단으로 분류 할 수 있 었고, I 집단은 유사도값 0.660을 기준으로 3 소군집, II 집단은 유사도값 0.737을 기준으로 3 소군집이 속하였다 (Fig. 2). II집단 C. ‘Place court’와 C. Pure Destiny ‘Ultimate’는 유사도가 0.920으로 높게 나타났다. 화색은 각 각 밝은 분홍색 및 연두색인 대형종으로 2월경에 개화 하는 두 품종은 화형이 비슷하고 설판 안쪽이 노란색을 띠는 공통점을 갖고 있다. C. ‘Fuzzy Color’의 경우 이 두 품종과 유사도 지수 0.866에서 근연관계가 가까운 것 으로 나타났는데 화색은 연분홍색이고 설판 및 화형이 두 품종과 유사하였다. 중형종인 C. ‘Julyang’과 C. ‘Tropical Yellow’도 0.908의 높은 유사도 지수를 보여 근연관계가 가깝게 나타났는데 화색은 초록색과 노란색이며 설판의 색과 화형이 비슷한 특징을 보였다. 화색이 다른 품종들 이 높은 유사도를 나타내고 같은 그룹으로 분류되기도 하 지만 이는 다른 원예적 형질들이 연관된 것으로 자세한 생육특성조사가 뒷받침되어 공통된 형태적 특징을 찾아 보는 것이 중요하다고 생각된다.
현재 심비디움 육종은 여러 가지 특성을 지닌 우수한 신품종을 개발하기 위하여 전통적인 작물육종법인 교배 육종법을 많이 이용하고 있는데 교배 모본 및 부본의 유 전적 분류와 유전자원의 다양성에 대한 연구는 매우 중 요하다. 국내외에서 수집 및 육성한 다양한 유전자원에 대한 유용한 형질의 DNA marker개발 및 분석 등의 과 학적인 선발지표마련이 지속적으로 이루어져야 할 것으 로 판단된다. 본 연구를 통해 심비디움 원종 및 품종 30 종간의 유전적 근연관계를 밝힘으로써 이후 심비디움 육 종 및 유전연구에 유용한 기초자료가 될 수 있을 것으 로 생각된다. 또한 육성품종들에 대한 DNA marker를 개 발과 차별화된 유전연구 등의 상호보완적인 연구수행을 통하여, 심비디움 품종을 육성할 때 유망계통들의 유전 적 구별성, 균일성, 차별성 확보와 교배모본 선정에 활 용하는 등 심비디움 육종의 기반기술로 유용하게 활용할 예정이다.
