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ISSN : 1225-5009(Print)
ISSN : 2287-772X(Online)
Flower Research Journal Vol.20 No.2 pp.75-82
DOI :

우리나라 참나리 2, 3배체 집단에서의 EST-SSR을 이용한 유전변이 분석

송예수1,3, Truong Nguyen Xuan1, 김남수2, 김종화1*
1강원대학교 농업생명과학대학 원예학과, 2강원대학교 의생명과학대학 분자생명과학과

Analysis of Genetic Variation in Native Korean Tiger lily (Lilium lancifolium Thunb.) by EST-SSRs.

Jong Hwa Kim1*, Song, Ye Su1, 3, Truong Nguyen Xuan1, Kim Nam Su2
1Department of Horticultural Sciences, Kangwon National Univ
2Department of Molecular Biosciences, Kangwon National Univ, 3Oriental bio-herb research Institute, Kangwon National University
Received 7 June 2012; Revised 11 June 2012; Accepted 12 June 2012.

Abstract

Phylogenetic analysis was carried out among the 56 diploid and triploid accessions of Liliumlancifolium (L.) that were collected throughout the Korea using EST-SSRs. Of the 13 informative ESTSSRs,7 primer sets were suitable for phylogenetic analysis of the diploid and triploid accessions. Diploidaccessions collected from the islands in Yellow sea, South sea, and Jeju island showed high genetic variationregardless of the geographic distances, whereas the triploid accessions collected from Socheong islandin Yellow sea, Ulreung island in East sea, and inland areas of Korean peninsula showed low genetic variation.The UPGMA phylogenetic tree with 121 polymorphic SSR bands revealed distinct clustering patternsfrom each other’s among the accession of the diploids from Acha-do (Yellow sea) and the diploids fromislands of South sea, and the triploid accessions from Socheong island showed distinct grouping from othersof Ulreung island and inland. Thus, the used EST-SSR markers can be utilized in the future for the analysisof demographic and identifying accessions among the diploid and triploid L. lancifolium accessions.

우리나라_참나리_2__3배체_집단에서의_EST-SSR을_이용한_유전변이_분석.pdf3.44MB

서 언

 백합속에는 약 90종이 아시아, 유럽, 북미에 분포하는 것으로 알려지고 있다(Synge, 1980; Asano, 1989). 이들 종들은 형태적(Comber, 1949) 또는 세포학적(Smyth et al., 1989) 데이터에 의해 7가지 Section으로 구분되는데, 이러한 형태적 분류는 최근에 RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA)나 ISSR (Inter-simple sequence repeat)과 같은 분자생물학적 연구에 의해 다시 정의되고 있다(Nishikawa et al., 2001; Yamaguchi et al., 2002).

 우리나라에 자생하는 나리는 Lighty(1969)가 11종을 보고한 이후 Leucolirion section 에 속하는 흰나리(일명 대만나리, L. formosanum)를 포함하여(Song, 1996) 12종이 자생하는 것으로 알려져 있다.

 이들 자생나리 중에서 가장 흔하게 관찰되는 종이 참나리로 전국 도서지방과 내륙의 해안, 도로변, 개울가, 민가근처 등에 자생 또는 식재 되어 있으며, 2배체와 3배체가 지리적으로 특이하게 구분되어 분포하고 있다(Kim et al., 2004, 2005, 2006). 중나리는 참나리와 매우 유사하지만 지리적 분포가 매우 제한되어 서남부 해안에서는 관찰하기 어렵다. 이러한 참나리의 지리적 분포와 2, 3배체로의 세포학적 분화의 메카니즘을 이해하기 위해서는 정밀하고도 재현성 높은 분자생물학적 해석이 필요한 실정이다. 또한 전국적으로 널리 자생하는 참나리도 각종 개발행위로 인하여 해안가와 내륙에서 많이 소멸되어가고 있기 때문에 유전자원으로서의 적정 보존 범위 설정을 위해서도 유전적 변이에 대한 이해가 요구되고 있다.

 3배체 참나리는 다른 백합속 식물보다 왕성한 무성번식 능력(주아)에 의해 집단을 유지시키는 것으로 생각되나(Noda, 1986), 무성번식에 의존하는 3배체 집단에도 다양한 유전적 변이가 존재하는 것으로 밝혀지고 있다. Noda(1986)는 참나리 염색체 4곳에서 관찰되는 인형성협착다형성 분석에 의해 일본의 3배체 참나리를 18계통으로 분류하였고, Ozaki(2002)는 allozyme분석에 의해 일본의 3배체 참나리에서 27가지의 유전자형을 보고한 바 있다. Shim et al.(2007)은 RAPD 분석에 의해 한국 3배체 집단의 63%에서 유전적 다형성을 관찰 한 바 있다. 그러나 이러한 참나리 3배체의 유전적 다양성이 어떠한 메카니즘에 의해 발현되는지는 밝혀진 바 없다. 3배체 참나리의 유전적 다양성과 발생기원을 밝히기 위해서는 보다 세밀하고 정확성이 있는 DNA마커 활용이 기대되고 있다.

 백합속에서의 분자마커 개발은 다른 식물에 비해 느린 편으로, ISSR (Abe et al., 2002), QTLs (Van Heusden et al., 2002; Shahin et al., 2011) 등의 단편적 마커 개발이 시도 되었고, SSR 마커는 Lilium philadelpicum 개체에서 6개의 마커가 보고된 바 있다(Horning et al., 2003). 그러나 여러 개의 백합 속 종에 대한 다양성과 재현성이 높은 SSR마커 시스템은 Lee et al.(2011)이 선발한 19개의 EST-SSR이 세계에서 처음이었다.

 본 실험은 Lee et al.(2011)이 선발한 19개의 ESTSSR중에서 우리나라에 자생하는 참나리 2, 3배체 집단에서의 유전적 다양성 분석에 활용 가능한 마커들을 선발하고 임의로 선택된 전국의 참나리 집단에 대하여 유전적 다형성 분석 가능성을 알아보기 위해 수행되었다.

재료 및 방법

식물재료

 본 연구에 사용된 한국자생 참나리는 강원대학교 유전자원 포장에 수집되어 보존되어온 것 중에서 한반도의 서해, 남해, 동해안의 해안지역에서 30계통과 경기, 강원, 충청, 경상 그리고 전라내륙지역에서 26계통의 참나리를 임의로 선별하였다. 선별된 참나리 유전자원들은 Allium cepa를 비교구로 Flow cytometry (Partec, Germany)를 이용하여 배수성을 확인하여 최종적으로 2배체 집단은 20계통, 3배체 집단은 36계통을 선정하였다(Table 1). 2배체 집단은 지리적으로 멀리 떨어져 있는 강화군 아차도에서 5계통, 전라남도 고흥 해안가에서 5계통, 완도군에서 5계통, 제주도에서 5계통, 총 20계통을 임의 선발하였다. 3배체 집단은 전국의 각 시도에서 임의로 36계통을 선정하여 하였다.

Table 1. Geographic location and ploidy levels of the plant materials analyzed.

 동일 섬이나 시, 도에서 전혀 다른 집단으로 생각되거나 리 또는 면 단위 이상 떨어져있는 집단의 계통을 선정기준으로 하였다. 특히, 서해의 소청도와 백령도, 동해의 울릉도에는 3배체 참나리만 분포하므로(Kim et al., 2006) 소청도에서 5계통, 울릉도에서 5계통을 선정하였다. 2배체는 거의 모두 해변가에 자생하는 것들을 수집하였고, 3배체는 민가, 도로변, 강변의 지역에서 수집되었는데 인위적 전파요인을 배제할 수 없었다.

DNA 추출

 Genomic DNA는 참나리의 어린잎에서 DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였고, 추출된 genomic DNA는 0.8% agarose gel 로 전기영동하여 약 25 ng ·㎕-1로 정량 하였다.

PCR 증폭 조건과 SSR 분석

 EST-Lilium에서 개발된 13개의 SSR-Primer를 사용하였다(Table 2, Lee et al., 2011). PCR 반응용액 조건으로는 약 50 ng의 genomic DNA와 1 μM의 reverse primer와 1μM의 forward primer, 0.1mM dNTPs, 0.75 mM MgCl2, 0.25 U i-StarMAX II Taq. Polymerase (iNtRON Biotechnology, Korea)를 1 X 반응용액으로 하여 최종부피 10㎕로 구성하였다. Li-Cor DNA Imaging system을 사용하기 위해서 forward primer 5’-말단에 phthalocyanine dye (IRDye®)가 labeling된 것을 사용하였다. PCR반응 조건으로 predenature으로 94οC에서 2분간 반응 후, 94οC 30초, 55οC 30초, 60οC 60초를 1 cycle로 35회 반복하여 72οC에서 5분간 반응하였다. PCR 증폭이 끝난 후, 10㎕의 loading buffer(98% de-ionized formamide, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.02% bromo phenol blue)로 혼합하여 사용 전까지 -20οC에서 보관하였다.

Table 2. Sequence information and number alleles of the selected highly informatics 13 EST-SSRs.

DNA Analysis

 증폭된 DNA band분석에 Li-Cor 4300 DNA Imaging system (LiCor BIO Science, USA)과 QIAxcel System (Qiagen®, Germany)을 사용하였다. Li-Cor 4300 DNA imaging system에서 6% denaturing (7.5 M urea) acrylamide Aisacrylamide gel(19:1)이 사용되었는데 0.8 X TBE buffer로 1500 V, 40W, 40mA로 30분간 pre-run으로 전기영동을 준비하였다. DNA sample은 사용 전에 95οC에서 5분 간 denature한 후 얼음에 냉각 처리 한 뒤, 1㎕를 gel에 로딩 하여 pre-run과 같은 조건으로 4시간동안 전기영동하였다. Li-Cor 4300 DNA Imaging system에 의해 DNA band를 확인하였다. 다른 한편으로, Gel cartridge (QIAxcel DNA High Resolution Kit (1200), Qiagen®, Germany)를 이용하여 증폭된 DNA band는 gel image와 Electropherogram (QIAxcel ScreenGel 1.0.1.0.)에서 분석되었다.

Data 분석

 각각 genotype과 SSR primer들에서 증폭된 polymorphism은 DNA 단편(allele)으로 기록되어 binary code(1/0)로 전환하였다. 유연관계는 UPGMA (un-weighted pair group methods using arithmetic averages logarithm) Unweighted Pair-Group 방법을 토대로 NTSYS-pc.V.2.1 Program을 이용하여 계통도를 작성하였다.

결과 및 고찰

EST-SSR 다양성

 Lee et al.(2011)이 개발한 Lilium -EST marker set (L-SSRs, eL-SSRs) 중 선별된 19개의 EST-SSRs이 참나리 종내 개체를 구별할 수 있는 primer 마커로서 유용한지에 대해 PCR amplification을 통해 확인하였다. 그 결과 19개의 EST-SSRs 중 9개의 primer (L27, L60, L61, eL17, eL42, eL47, eL65, eL70, eL80)는 monomorphic band 양상을 형성하여 참나리 유전분석에 적합하지 않았고, 10개(L05, L09, L20, L59, L66, L67, eL16, eL28, eL64, eL75)가 참나리 유전적 분석에 적합하였다. 그 이외에 3개의 L01, L54 그리고 특히 eL40 primer는 참나리와 중나리 집단에서 polymorphic band을 보여주어 참나리 종내 개체 유전 분석에 적합한 것으로 사료된다. 21 polymorphic band를 나타내는 primer는 eL64이고, L67은 2개의 polymorphic band가 관찰되었다(Table 2). 특히, L01, L05, eL16, eL28과 eL40의 다양한 polymorphism은 2배체 종내의 구별에도 유용할 것으로 사료되었다. L05, L09, L20은 2배체와 3배체간의 다른 밴드패턴이 관찰되었다(Fig. 1). 최종적으로 참나리 종내 유전적 다양성 분석에는 L01, L05, L09, L20, eL16, eL28, eL40등을 주로 한 EST-SSRs들이 유용한 것으로 선발되었다.

Fig. 1. EST-SSRs in 56 native Korean Tiger lily accessions (Lilium lancifolium Thunb.). A & B: Li-Cor DNA Image System, C & D: QIAxcel Screen Gel; A, B, C are D indicate marker eL28, L01, L05 and L20. Numbers mean the site No. in Table 1. Lanes from 1 to 20 are diploid lines and from 21 to 56 are triploid lines.

유전적 다양성 및 유연관계

 다형성을 나타낸 SSR마커들은 종자번식을 하는 2배체에서는 매우 다양한 밴드 패턴을 나타냈으나, 3배체 참나리에서는 비교적 변이가 적은 것으로 나타났다. 섬지역이나 해안가에 자생하는 참나리 중 지역적으로 멀리 떨어져 있는 옹진군 아차도, 전남 고흥과 완도, 제주도의 2배체들을 비교한 결과 모든 2배체 분포 해안 지역에서는 매우 다양한 밴드패턴을 나타냈다(Fig. 1).

 한편 3배체 중에서 섬지역에 고립되어 있는 소청도와 울릉도의 마커패턴(L05)을 비교한 결과 소청도 3배체 참나리는 울릉도와 내륙의 3배체와 매우 다른 양상을 나타냈다(Fig. 1. C).

 Lilium-EST에서 개발된 SSR에서 유래된 polymorphic 형성을 나타낸 총 121개의 polymorphic SSR밴드를 사용하여 UPGMA방법으로 계통도를 작성한 결과 2배체 집단에서는 유전적 변이가 다양한 반면, 3배체 집단에서는 비교적 변이가 적은 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고 3배체 집단에서도 일부 계통들은(예; Site No. 37, 41, 55, 56)은 2배체 만큼의 유전적 다양성을 나타내기도 하였다. 이러한 사실은 무성번식에 종보존을 유지하는 식물에서 3배체의 유전적 다양성은 돌연변이보다는 유성적 메카니즘이 크게 관여할 것이라는(Ellstrand and Roose, 1987) 가설을 뒷받침해 주는 결과로 생각된다.

 특이한 점으로는 2배체 집단 중에서 아차도의 계통들(site No. 1, 2, 3, 5)은 남해안의 2배체들(site No. 7-20)과 뚜렷이 분리된 cluster를 형성하였다(Fig. 2).

Fig. 2. A phylogenetic dendrogram of 56 native Korean Tiger lily accessions (Lilium lancifolium Thunb.) on the basis of 121 polymorphic SSR bands from 13 SSR profiles. Numbers mean the site number in Table 1. 3xs mean the triploids and the others diploids.

 강화군 아차도는 매우 작은 섬이지만 RAPD 분석에서 (Shim et al., 2007) 가장 다양한 밴드 패턴을 보였던 지역으로 지리적으로 멀리 떨어져 있는 제주도와 전라남도 지역의 2배체들과의 유전적 유사성을 알아 보기 위해 선정되었고, 본 연구에서 이들간의 유연관계가 낮은 것으로 나타났다. 3배체 집단에서 독특한 밴드패턴을 나타내었던 소청도 계통들(site No. 21, 22, 23, 24)은 cluster 분석에서도 다른 3배체들과 분리된 집단으로 나타났다(Fig. 2). 이와 같이 본 연구에서 선발된 EST-SSR 마커들은 참나리 집단의 지리적 분포와 유전적 다양성 분석에 매우 유용하게 사용될 것으로 사료되었다. 보다 많은 지역의 참나리 집단에 대한 SSR 분석은 우리나라 참나리 집단의 종내 분화양상을 이해하기 위한 중요한 시발점이 될 것으로 기대하고 있다.

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