분자표지를_이용한_둥근잎_나팔꽃의_Ivory_seed_유전자_형질_분리.pdf3.16MB

• 서 언
• 재료 및 방법
• 결과 및 고찰

서 언

 화색은 관상식물의 가치평가에 영향을 주는 식물 표현형 가운데 하나다. 식물의 꽃색은 플라보노이드를 대표하는 안토시아닌을 포함하여, 카로티노이드 및 베타레인에 의해 채색된다(Bartley and Scolnik, 1995; Cai et al., 2005; Forkmann, 1991). 특히, 안토시아닌은 가장 대표적인 식물 색소로 색의 변화가 쉽게 관찰되기 때문에 오랜 기간 연구자들의 관심의 대상이 었다(Hiram, 1934; Holton and Cornish, 1995; Mol et al., 1998). 안토시아닌 발현은 각각의 식물체가 가지는 유전적 소질에 의해 독특한 양상으로 나타나고 그 양상은 다음 세대에 전달된다. 목표형질을 확인하기 위해 단일 유전자좌의 대립형질은 교잡 2세대(F₂)의 표현형 분석을 거쳐야 하는데 목표형질이 늘어 날수록 형질분석에 시간적 경제적 비용이 많이 소요된다. 그러나, 다양한 표현형을 수집하고 분자분석을 통해 각 유전자형에 따른 특이적 분자마커를 개발하고, 이용한다면 육종에 소요되는 시간과 노력을 대폭 절약할 수 있다. 따라서 육종방법의 개선이나 육종의 기반 조성을 위해 종간 유연관계나 품종구분에 이용할 수 있는 특정 형질에 대한 분자마커의 개발이 많이 시도되고 있다(Kim et al., 2011; Lee et al., 2011). 특히, 안토시아닌 발현과 같은 단일형질에 대한 확실한 분자마커를 분리 활용한다면 다양한 화색 변이종의 분석과 형질교잡을 통한 화색예측이 가능하기 때문에 육종에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

 나팔꽃 속 식물의 주요 화색물질은 안토시아닌이다. 원예적으로 널리 이용되는 I. tricolor와 I. nil 야생형 계통의 안토시아닌은 시아니딘 B환의 3번째가 메칠화 되어 있는 페오니딘계 안토시아닌인 heavenly blue anthocyanin(HBA)으로 알려져 있다(Kondo et al., 1987; Lu et al., 1992). 지금까지 다양한 화색 돌연변이종이 수집 또는 분리 되었는데(Iida et al., 2004), 안토시아닌 생합성을 촉매하는 효소를 암호화하는 대부분의 유전자가 동정되었다(Chopra et al., 2006). 다양한 화색 돌연변이체에는 형질발현이 안정화된 완전변이체와 화색발현 양상에 변화가 있는 불완전 변이체가 포함되어 있는데(Iida et al., 2004), 돌연변이 원인 유전자는 정상유전자와 비교하여 살펴보면, 차이가 나는 DNA 염기서열을 가지기 때문에 그 차이를 형질교잡, 분리 또는 형질확인을 위한 분자마커로써 활용할 수 있다. 화색과 종자색의 발현이 동시에 저하되는 돌연변이종도 분리되었는데 전사조절인자인 bHLH (basic helix-loop-helix) 단백질을 암호화하고 있는 IVS 유전자 또는 WDR1(WD40 repeats 1) 단백질을 암호화하고 있는 Ca 유전자는 안토시아닌과 proanthocyanidin(프로안토시아니딘) 발현뿐만 아니라 종자의 phytomelanin 색소와 모용(trichome) 형성에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Morita et al., 2006; Park and Hoshino, 2012; Park et al., 2004, 2007).

 본 연구는 이전 연구를 통해 나팔꽃에서 분리한 안토시아닌 생합성 및 종자색 돌연변이체와 관련된 여러 대립형질을 활용하여 몇몇 지역에서 새롭게 수집된 화색 및 종자의 착색에 관여하는 원인 유전자를 탐색하고 표현형 해석을 위해 이용된 분자표지의 타당성을 검토하였다. 이러한 결과를 바탕으로, 나팔꽃의 화색과 종자색 형질에 대한 분자마커를 선발하였다.

재료 및 방법

 화색과 종자색이 야생형인 종으로는 FP39 계통(Fig. 1A and C; Park et al., 2007)을 사용하였다. 분석에 사용된 나팔꽃 종자는 2005년 미국과 프랑스로부터 수집한 I. purpurea 계통으로 후대 분리검정을 실시하지 않은 아이보리색의 종자였다(Fig. 1B). 인공포트에서 종자를 발아시킨 후, 유식물체의 잎이 2매가 전개 되었을 때, 인공 배양토가 들어있는 30×50 cm의 사각화분에 옮겨 관리하였다. 활착된 식물체를 자동 온실에서 생육시키면서 표현형을 관찰하였다. 개화 시 꽃의 화색발현에 따라 4가지 표현형 즉, full purple(FP1-3), magenta(M), pale purple(PP) 및 pale red(PR)의 화색을 보이는 6개체의 식물체를 선발하여 실험재료로 사용하였다. 흰색 꽃과 아이보리 종자의 WR4 계통은 ivs-stb 변이형질(Park et al., 2007)을 가지는 종으로 대조구로 사용하였다.

Fig. 1. Seed and flower phenotypes of I. purpurea. Wild type FP39 (A, C), ivory seeds collected from France and America (B), FP (full purple, D), PP (pale purple, E), M (magenta, F), PR (pale red), and WR4 (H).

 DNA의 추출을 위해 액체질소에서 동결시킨 어린 잎 1 g을 유봉과 유발을 사용해 마쇄한 후, 20 mL의 carlson lysis buffer[100 mM Tris-HCl (pH9.5), 2% CTAB, 1.4M NaCl, 1% PEG6000, 20 mM EDTA]를 사용하여 균질화시킨 다음, 70^οC의 항온수조에서 20분간 처리하였다. 그 후, 동량의 chloroform-isoamyl alcohol(24:1)로 처리한 수용층의 상등액을 RNase A(Takara, Japan)로 처리하였으며, genomic tip 500/G column(Qiagen, Germany)을 사용하여 Hoshino et al.(2009)의 방법에 따라 추출하였다. RNA는 개화 전 24시간 전의 꽃봉오리로부터 Takahashi et al.(1999)의 방법에 따라 추출하였다. Southern 및 Northern blot 분석에 사용된 bHLH2 유전자의 표식용 probe는 full length cDNA(Park et al., 2004)를 사용하였다.

 Reverse transcription-polymerase chain reaction(RTPCR) 분석을 위해 꽃봉오리에서 추출한 total RNA (5 μg), SuperScript II Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen)를 사용하여 RT를 수행하였으며, 합성된 cDNA를 5배 희석하여 PCR에 사용하였다. Genomic PCR에는 DNA 100 ng을 사용하였으며, 모든 PCR은 Taq DNA polymerase(Takara)를 사용하여 3 step으로 수행하였다. bHLH1, bHLH2, R2R3-MYB 및 WDR 유전자의 증폭에 사용한 PCR primer 쌍은 각각 MYC1-5’ (5’-AGCCACAACCAGCTACCTGCACC-3’)과 MYC1-3’ (5’-GAGTGACTGTATCTCCCAGA-3’), IpMF3와 IPMYC3-3’ (Table 1), IpMYB1-5’ (5’-CTCTAGCTAGCTAGCTACCCAC-3’)과 IpMYB1-3’ (5’-AGACTCCATGTTAAATGGTTGTGTC-3’), 그리고 IpWD2-5’ (5’-CGGCGAGTCAACGTTCGGAGG-3’)과 IpWD2-3’ (5’-AGATAACCAATTACAGACACATACC-3’)였으며, PCR은 최초 94^οC에서 2분간 변성을 실시한 후, 94^οC(30 sec), 60^οC(30 sec), 72^οC(2min)의 3 step 을 30 cycle로 수행하였다. RT-PCR 분석(Fig. 4B)에 사용된 primer는 IPMYC3-5’과 IPMYC3-3’(Table 1)를 사용하여 genomic PCR과 동일한 반응조건에서 수행하였으며, GAPDH2-Fw1과 GAPDH2-Rv1 primer로 GAPDH2 유전자를 증폭하여 개체간 전사량의 차이를 보정하기 위해 비교하였다(Table 1). 분자마커 선발을 위한 PCR도 Table 1과 같은 반응 조건에서 30cycle로 수행하였다.

Table 1. Primers used for PCR and RT-PCR analyses.

결과 및 고찰

 I. purpurea의 야생형(FP39)의 종자는 짙은 암갈색인 반면, 미국과 프랑스에서 수집된 종자색은 아이보리였다(Fig. 1A and B). 프랑스에서 수집된 종자 중에서 화색이 야생형FP39(Fig. 1C)와 유사한 진한 보라색 꽃을 보여 FP-1, FP-2, FP-3(Fig. 1D)로 분류하였고, 미국에서 수집된 종 가운데 연한 청색은 PP(Fig. 1E), 진한 적색계는 M(Fig. 1F), 그리고 연한 적색계는 PR(Fig. 1G)로 각각 분류하였다. 적색계인 M과 PR의 경우, flavonoid 3'-hydroxylase(F3'H) 유전자의 돌연변이형질인 pink 대립형질(Hoshino et al., 2003)을 내재하고 있어, 적색계의 안토시아닌인 pelargonidin을 생성하는 것으로 판단되었으며, 특히 PR은 PP와 함께 화색이 옅어지는 변이와 종자색 변이를 모두 가지는 열성돌연변이체일 것으로 추정되었다. 이전 연구에서, 나팔꽃의 종자색과 관련된 유전자는 안토시아닌 생합성을 촉진하는 전사조절인자 가운데 bHLH, WDR1 단백질을 각각 암호화하고 있는 IVS 및 CA 유전자로 이들 유전자의 돌연변이는 화색 및 종자색 모두에서 착색이 저조한 것으로 보고된 바있는데(Morita et al., 2006; Park et al., 2004), PP와 PR 계통은 IVS 유전자의 변이체와 화색 발현이 유사하였다(Park et al., 2007). FP 계통은 M계통과 함께 짙은 안토시아닌 발현을 보이기 때문에 안토시아닌의 축적과 관련된 IVS 및 CA 유전자와는 관련이 없는 새로운 변이종이거나, 종자형성시 교잡오염으로 인해 이들 유전자의 이형접합체 상태일 것으로 추정되었다.

 안토시아닌, 프로안토시아니딘, 잎과 줄기의 모용 등 식물의 표피세포에서 일어나는 형질발현은 전사조절인자로 구성된 단백질 복합체와 관련되어 있다(Ramsay and Glover, 2005). 이 단백질 복합체는 R2R3-MYB(MYB), bHLH(1, 2), WDR motif를 지니는 단백질로 구성되는데, IVS와 CA 단백질은 각각 bHLH2, WDR군에 속한다(Morita et al., 2006; Park et al., 2004). 또한, MYB단백질군에 속하는 애기장대의 TT2 단백질은 종자의 proanthocyanin 축적에 관여하여 종자색 발현에 영향을 미친다(Nesi et al., 2001). 따라서, 관련 전사조절인자를 암호화하는 유전자에 대해 genomic PCR분석을 실시하였다(Fig. 2). 유전자 각각의 게놈영역에 대한 PCR 결과, bHLH1, MYB 및 WDR 영역의 PCR 산물의 크기는 야생형인 FP39와 동일하였지만, bHLH2 유전자인 IVS 유전자영역(exon3~exon8)에서 야생형과는 크기가 다른 PCR 산물이 관찰되었다. 모든 계통이 WR4 계통(Fig. 1H)이 지니고 있는 ivs-stb 변이형질과 크기가 동일한 PCR 산물을 보여 이들 계통은 모두 ivs-stb 대립형질을 지니고 있을 것으로 추정되었다. 그러나, M 계통의 경우 WR4와 동일한 ivs-stb 형질을 지니면서 야생형의 IVS 유전자와 동일한 크기의 PCR 산물을 나타내어 이형접합체 인 것으로 확인되었으나, FP 계통은 안토시아닌 축적 표현형이 야생형과 유사함에도 불구하고 야생형과 동일한 크기의 PCR 산물이 증폭되지 않았다. IVS 유전자의 영역은 프로모터 부분을 제외하더라도 크기가 약 6 kb를 넘을 뿐만 아니라 5’ 영역의 PCR 증폭이 용이하지 않기 때문에 전체 구간을 한번에 증폭하여 비교하기 어렵다(Park et al., 2004).

Fig. 2. Genomic PCR analysis of regulatory loci in FP, PP, M and PR lines separated from ivory seeds. Alleles are indicated in Fig. 1.

 따라서, 5’ 영역을 포함한 전 유전자 영역을 PCR 증폭이 가능한 여러 구간으로 나누어 확인할 필요가 있을 것으로 판단되었다. Fig. 3A는 IVS 유전자의 게놈 영역을 모식도로 나타낸 것으로 아미노산을 암호화하고 있는 영역을 모두 포함하고 있으며, ivs-stb에는 두번째 exon과 5번째 intron에 Mutator type의 DNA형 전이인자인 Mu1(838 bp)과 Mu2(828 bp)가 각각 삽입된 것이 보고되었다(Park et al., 2007). IVS 유전자 영역을 여러 구간으로 나누어서 증폭된 PCR산물들이 일정 부분이 서로 겹치도록 primer를 작성하였다(Fig.3A and Table 1). 총 11구간으로 나누어 PCR을 수 행한 결과, 4개의 구간에서 PCR산물의 크기에 차이가 관찰되었다(Fig. 3B). 짙은 적색계인 M계통은 4구간 모두에서 야생형 IVS 및 변이형질인 ivs-stb 유래의 PCR 산물을 동시에 보여 앞서 예측한 바와 같이 이형접합체임이 확인되었고, 화색이 옅은 계통인 PP와 PR은 PCR 산물이 모든 구간에서 ivs-stb와 동일하여 ivs-stb 대립형질일 것으로 판단되었다. FP 계통은 Fig.2에서와 같이 3번째 exon을 포함한 3’ 영역에서의 결과는 ivs-stb allele과 동일하였으나 두번째 exon영역에 대한 PCR 결과에서 야생형 및 ivs-stb 형질 모두의 산물이 증폭되어 이형접합자임을 확인할 수 있었다. 특히, PCR 결과를 살펴보면, FP 계통의 IVS는 다섯번째 intron에 IpMu2가 삽입되어 있고 두번째 exon에는 IpMu1.이 삽입되지 않은 ivs-pwt(Park et al., 2007)와 동일한 대립형질일 것으로 추측하였다. ivs-pwt와 ivsstb 형질은 전이형질의 삽입을 제외하고는 DNA 염기서열이 서로 상동하는 것으로 보고되었는데(Park et al., 2007), intron 6영역의 PCR 결과에서도 FP계통의 IVS 형질은 WR4 계통의 ivs-stb 형질과 동일한 크기의 PCR 산물을 보여 최종적으로 ivs-pwt로 판단하였다. ivs-pwt는 형접합자 상태에서 FP39의 야생형 IVS에 비해 전사량이 다소 떨어지지만 화색 표현형에 있어서는 야생형과 큰 차이를 보이지 않았기 때문에 정상적인 IVS 기능을 가지는 것으로 보고된 바 있다(Park et al., 2007).

Fig. 3. Allelic separation at the IVS locus by selection of molecular marker. (A) Structure of IVS and ivs-stb. Numerals with white box indicate exons. Mu1and Mu2 are inserted in ivs-stb. The IVS gene region was amplified by PCR into 11 blocks containing regions of (B), which are indicated under the IVS gene structure. The primer sets are in Table 1. (B) The polymorphic regions detected by PCR analysis in (A). Amplified regions are indicated at the left side of each image. Alleles are indicated in Fig. 1.

 이전 연구결과에서 몇 종의 ivs 변이형질이 분리되었는데, 이들 대립형질간의 차이는 Southern blot 분석에서 명확하게 구분가능하였다(Park et al., 2007).

 따라서, 본 실험에서 PCR 결과를 토대로 추측한 계통간의 차이를 좀더 명확히 확인하기 위해 이전 연구와 동일한 방법으로 Southern blot 분석을 실시하였다(Park et al., 2007; Fig. 4A). 예상했던 바와 같이, IVS 유전자 영역을 제한효소 XbaI으로 절단하였을 때, 짙은 적색의 M은 FP39와 동일한 12 kb 밴드와 WR4와 동일한 약 8.6 kbp ivs-stb 대립형질의 밴드를 모두 보였고, PP 및 PR에서는 ivs-stb의 밴드만이 관찰되었으며, FP계통의 3식물체는 ivs-stb 밴드 뿐만 아니라 ivs-stb 밴드보다 약 800 bp 정도가 작은 약 7.8 kb의 ivs-pwt 대립형질의 밴드도 관찰되어 PCR 결과와 일치하였다(Fig. 4A; Park et al., 2007). 화색의 표현형이 야생형과 유산한 FP 계통의 꽃에 야생형과 동일한 전사 산물이 축적을 확인하고자 FP-1의 꽃에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 실시한 결과, 야생 형과 동일한 정상적인 크기의 전사산물이 축적되고 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 4B, left). 또한, Northern blot 분석에서 ivs-stb 대립형질만을 지니는 PP 및 PR에서는 이전 연구에서와 동일하게 정상적인 IVS 유전자의 전사산물이 축적되지 않음을 확인하였다(Fig. 4B, right; Park et al., 2007)

Fig. 4. Southern blot analysis of the IVS gene and expression of the ivs alleles. (A) Southern blot analysis. Genomic DNAs (10 μg) cleaved with XbaI were separated and hybridized with a probe full length probe of the IVS cDNA. (B) RT-PCR (left) and Northern blot (right) analyses. RT-PCR were conducted for 30cycles (see Material and Methods) and primers are indicated in Table 1(see material and methods). Total RNAs (10 μg) of flower buds were separated and hybridized with the same probe in (A). Alleles are indicated in Fig. 1.

 본 연구에서 화색과 종자 색의 착색을 활성화하는 IVS 유전자에 대해 분자마커를 이용한 형질분리가 가능하였고 4개의 구간에서 분자마커가 선발되었다(Fig.3B). 특히, exon 2와 intron 5 영역을 PCR로 증폭할 경우, 야생형 IVS, ivs-stb 그리고 ivs-pwt의 3가지 대립형질의 분리 및 확인이 용이하였으며(Fig. 3B), PCR로 예측된 결과는 Southern blot 결과와 정확하게 일치하였다(Fig. 4A). 분자마커를 통해 도출한 결과를 모식도로 나타내면 Fig. 5와 같다. 야생형인 FP39에 비해 화색이 옅은 PP와 PR은 ivs-stb 대립형질을 가진 열성 동형접합체, M은 야생형과 ivs-stb를 지닌 이형접합체 그리고 FP는 ivs-stb와 ivs-pwt를 지닌 이형접합체임을 알 수 있다. 실제로, PP와 PR에서는 아이보리 색의 종자가 그리고 M과 FP 계통에서는 짙은 갈색의 야생형 종자가 맺히는 것을 관찰할 수 있었다.

Fig. 5. Scheme of allelic constitution at the IVS locus confirmed from molecular analyses. Lines are indicated in Fig. 1. Homo and hetero represent homozygote and heterozygote in the IVS alleles, respectively.

 변이의 원인유전자를 탐색하기 위하여 사용한 분자표지나 원인 유전자의 대립형질 분리를 위하여 선발된 분자마커가 형질분리에 정밀한 도구가 될 수 있음을 확인하였다. 또한, 분자마커는 표현형이 야생형과 동일한 이형접합체의 선별에 있어서도 효과적임을 확인하였다.

 변이형질의 경우, 변이원인이 DNA 염기서열에 흔적을 남긴다. 완전변이의 경우에는 단백질을 암호화하고 있는 영역의 DNA 염기서열이 삭제되거나 치환 또는 비자율성 전이인자의 삽입 등에 원인이 있지만 (Hoshino et al., 2003, 2009), 불완전 변이는 자율성전이인자의 삽입이나 DNA 메칠화(methylation)가 원인인 경우가 많다(Inagaki et al., 1994). 어떤 경우든 DNA 염기서열의 차이는 형질을 구분할 수 있는 분자마커로써 활용가능하다. 품종 육종시 획득된 F₂ 세대 개체들이 어떤 형질을 지니는지 빠른 시간 내에 파악이 가능하다면 모든 개체의 표현형을 확인하는 노력을 줄일 수 있을 뿐 아니라 공간 활용의 이점도 부수적으로 얻게 된다. 또한, 자율성 전이인자의 활용이나, 특정 유전자의 promoter 영역의 활용 및 종내에 존재하지 않는 형질 등에 대한 분자마커는 생명공학 기술과 접목되어 분자육종이라는 새로운 분야로 발전되고 있다(Tanaka and Ohmiya, 2008). 따라서, 목표형질에 대한 분자마커의 수집과 개발은 기존에 수행되어 온 전통적 육종뿐만 아니라 생명공학 기술을 이용한 분자육종의 발전에도 기여할 것으로 생각된다.