나팔꽃의_꽃과_종자_착색에_관여하는_유전자의_동정과_특성.pdf1.49MB

서 언

 속씨식물의 많은 종들은 꽃을 통해 생존하고 번식한다. 꽃은 종자를 맺기 위한 도구로써, 수분(pollination)을 도울 동물을 유혹하기 위해 향기, 밀선, 모양, 색등의 다양한 흥미거리를 진화시켰다. 특히, 꽃의 색은 오늘날 많은 연구자나 육종가들의 관심의 대상이며, 국내에서도 다양한 화색 화훼류들이 육성되고 있다(Cho et al., 2011; Kwon et al., 2011). 꽃색 가운데 안토시아닌은 붉은색과 청색을 대표하는 식물의 대표적인 2차대사산물이다(Chopra et al., 2006). 안토시아닌은 chalcone synthase(CHS)라는 촉매효소로부터 시작하여 약 10여개 이상의 효소작용에 의해 생합성되고(Fig. 1), 이 효소들을 암호화하고 있는 유전자는 전사조절인자에 의해 활성화된다(Mol et al., 1998). 전사조절인자는 R2R3-MYB(MYB), bHLH 그리고 WD40-repeat(WDR)로 대표되는 단백질군을 포함하고 있으며, 이들 각각의 단백질은 단독 혹은 상호간 복합체를 형성하여 하류의 구조유전자의 발현을 활성화 한다(Koes et al., 2005). 특히, 이들 세 유전자의 결합체 즉, MYBbHLH-WDR 단백질 복합체는 안토시아닌 발현을 비롯한 다양한 표피세포의 형질발현에 관여하고 있다(Ramsay and Glover, 2005).

Fig. 1. Anthocyanin biosynthetic pathway in plants. The enzymes are 3GT, UDP-glucose:flavonoid 3-O-glycosyltransferase; ANS, anthocyanidin synthase; CHS, chalcone synthase; CHI, chalcone isomerase; DFR, dihydroflavonol 4-reductase; F3H, flavanone 3-hydroxylase; F3'H, flavonoid 3'-hydroxylase; and F3'5'H, flavonoid 3',5'-hydroxylase.

 Ipomoea 속 식물은 전세계적으로 600여종이 분포하고 있으며 그 가운데 I. nil, I. purpurea 및 I. tricolor가 원예적으로 널리 이용되고 있다(Iida et al., 2004). 야생형 나팔꽃의 꽃색은 개화시 순수 청색을 나타내는 heavenly blue anthocyanin으로 유명한데 I. tricolor의 ‘Heavenly blue’에서 최초로 분리되었기 때문이다(Kondo et al., 1987). 지금까지 많은 화색 변이체가 수집되었고, 안토시아닌 생합성을 촉매하는 효소를 암호화하고 있는 대부분의 유전자가 동정되었다(Fig. 1; Iida et al., 2004). 화색과 더불어 종자의 착색이 결여된 종들도 함께 수집되었는데, I. tricolor의 화색 및 종자색 변이종의 경우 전사조절인자인 bHLH 단백질을 암호화하고 있는 IVS 유전자의 돌연번이에 의해(Park et al., 2004), 그리고 I. nil의 ca 변이종은 WDR 단백질을 암호화하고 있는 Ca 유전자의 이상이변이발생의 원인으로 확인되었다(Morita et al., 2006). 이들 두 유전자는 꽃의 안토시아닌 생합성뿐만 아니라 짙은 갈색 또는 검은색의 종자색 착색에도 관여하는 것으로 알려져있다(Morita et al., 2006; Park et al.,2004). 나팔꽃의 종자색은 phytomelanin으로 보고되었으나, 최근의 연구에서 proanthocyanidin도 포함되어 있는 것으로 알려졌다(Park and Hoshino, 2012;Park et al., 2007)

 본 연구는 Park et al.(2004, 2007)과 Morita et al.(2006)의 연구결과를 토대로 I. purpurea 종에서 수집되거나 선발된 두 변이종의 변이 원인 유전자를 탐색하고, 화색 및 종자색에 관여하는 새로운 대립형질이나 유전자를 분리하고자 실시하였다. 이를 위해, 꽃과 종자의 착색이 불완전하거나 저해된 두 I. purpurea 변이종에 대해 분자마커를 이용한 PCR 검정을 통해 변이 원인 유전자를 검토하고 이후 검정된 유전자의 DNA 염기서열 분석을 통해 그 특징을 구명하고자 하였다.

재료 및 방법

 식물재료로는 일본 기초생물학연구소에서 수집하거나 분리한 계통으로 화색이 야생형인 짙은 보라색의 I. purpurea FP39 계통(Park et al., 2007)과 옅은 핑크색의 KK-1 계통 및 흰색의 W-4 계통을 사용하였다. 각 계통의 나팔꽃 종자를 멸균된 인공배양토로 채운 30 × 50 cm의 사각화분에 심어, 유전적 오염을 막기위해 수분 곤충이 없는 온실에서 생육시키면서, 육안으로 표현형을 확인한 후, 분석용 재료로 사용하였다.

 핵산(DNAs, RNAs) 추출, Northern, Southern blot분석 및 DNA 염기서열 분석은 Park 등(2004)의 방법에 따라 수행하였다. DNA는 어린 잎으로부터 그리고 total RNA는 개화하기 36시간 전의 꽃 봉오리로 부터 각각 추출하였다. Northern 및 Southern blot분석에 사용된 CHS-D, DFR-B, 3GT 및 bHLH2 유전자의 표식용 probe들은 Park et al.(2004, 2007)이 사용한 방법과 동일하게 사용하였다.

 Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 분석을 위해 개화 36시간 전의 꽃봉오리에서 추출한 RNA(1 μg) 및 SuperScript III ReverseTranscriptase Kit(Invitrogen)를 사용하여 1^st -strand cDNA를 작성한 후, 이 cDNA를 사용하여 유전자의 발현을 확인하였다. PCR 은 Taq DNA polymerase(Takara)를 사용하여 수행하였으며 모든 PCR은 3step의 30 cycle로 수행하였다. PCR에 사용된 primer 및 반응조건은 Table 2와 같다.

결과 및 고찰

  I. purpurea 야생형 FP39계통은 진한 보라색의 꽃을 피우고 검은 종자를 맺는 반면(Fig. 2A and F), 두 변이 식물 KK-1과 W-4 각각 안토시아닌 발현이 적은 옅은 핑크색 혹은 흰색의 꽃을 피우며 공통적으로 아이보리색의 종자를 생산한다(Fig. 2C, D, G and H). KK-1 계통은 안토시아닌 생합성에 중요한 유전자인 CHS-D 유전자에 Tip100이라는 Enhancer/suppressormutator(En/Spm) superfamily에 속하는 3.9 kbp의 자율성 전이인자가 삽인된 변이체(Habu et al., 1998)로부터 분리되었다. chs-d 변이체는 Fig. 1B와 같이 전이인자의 전이에 의해 화색이 야생형으로 돌아오는데 (Fig. 1B), 이 부분의 안토시아닌 발현이 떨어지는 변이종을 최초로 분리하였다. 그 후 CHS-D 유전자좌의 전이인자가 완전히 전이되어 야생형 CHS-D로 회복된 복귀돌연변이 즉, 흰부분이 없어지고 꽃의 전부분이 옅은 핑크색을 띠는KK-1 (Fig. 1C) 계통을 분리하였다. KK-1 계통은 FP39 계통과의 F₁ 에서 야생형과 동일한 표현형을 나타내는 열성 변이체로 확인되었는데 드물게 야생형과 동일한 색의 발현을 보이는 국지적 복귀부위를 꽃과 종자 모두에서 보이는 것으로 보아(Fig. 2C and G), 가변성 대립형질이 두 형질의 발현에 관련된 것으로 판단되었다. W-4 계통은 흰꽃을 피우고 종자색은 KK-1 계통과 동일한 아이보리색을 나타내지만, 부분복귀를 보이지 않는 안정화된 대립형질이 내재되어 있을 것으로 생각되었다(Fig. 2D and H). 야생형과의 F₁ 세대에서 야생형과 동일한 표현형을 보여 KK-1과 마찬가지로 열성 변이체로 확인되었지만, F₂ 세대의 분리에서 청색계, 적색계 등 다양한 표현형 분리를 보여 추가적인 유전적 형질을 내포할 것으로 판단되었다. 이 두 변이종은 Fig. 2E의 가운데와 오른쪽 실생묘에서와 같이 꽃의 안토시아닌 발현과 더불어 식물체의 다른 부위에서도 안토시아닌 축적이 저조한 것으로 나타났다(Fig. 2E).

Fig. 2. Phenotypes of I. purpurea species used. Wild type FP39 (A, F), a chs-d mutant allele, flaked (B), KK-1 (C, G), W-4 (D, H), and seedlings (E) of FP39 (left), KK-1 (middle) and W-4 (right).

 먼저, 두 변이종은 안토시아닌의 생합성능 혹은 축적능이 떨어지기 때문에 돌연변이 원인 유전자를 탐색하기 위해 안토시아닌 생합성 과정에 관여하는 유전자의 전사량을 관찰하였다(Fig. 3A). 그 결과, 조사된 생합성 경로 유전자 전체의 전사산물 축적이 야생형 FP39에 비해 떨어졌는데, 이는 앞서 보고된 ivs 돌연변이종(Park et al., 2004, 2007), c1 및 ca 돌연변이종 즉, 전사조절인자 돌연변이종의 결과와 유사하였다(Morita et al., 2006). 특히, W-4의 경우 안토시아닌 생합성경로의 후기를 담당하는 DFR-B 유전자와 안토시아닌 당화 효소인 3GT를 코드하고 있는 유전자의 발현이 크게 감소함 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 이들 결과로부터 두 변이체의 돌연변이 원인이 안토시아닌 생합성 경로의 어느 특정 단계를 촉매하는 효소가 아닌 생합성 경로 전체를 조절하는 전사조절인자를 암호화하고 있는 유전자의 발현과 관련되어 있을 것으로 판단되었다. Table 1은 쌍자엽식물인 애기장대와 페튜니아 그리고 나팔꽃의 안토시아닌 발현과 관련된 전사조절인자를 나타낸 것이다. 대표적으로 R2R3-MYB, WDR 및 bHLH motif를 지니는 단백질군으로 구분되며 bHLH 의 경우 1 type과 2 type으로 나눌수 있다(Table 1). 이들은 모두 안토시아닌 생합성을 지배하지만 이들 중 bHLH2 와 WDR은 종자색의 발현에도 관여하는 것으로 알려져 있다(Table 1; de Vetten et al., 1997; Morita et al., 2006; Nesi et al., 2000; Park et al., 2004, 2007; Spelt et al., 2002; Walker et al., 1999). 따라서, 이들 유전자에 대해 RT-PCR분석을 실시한 결과, 두 변이종의 경우 bHLH2를 암호화하고 있는 유전자가 전사량이나 전사산물의 크기에서 야생형인 FP39와는 다른 것으로 확인되었다(Fig. 3B). RT-PCR에서 야생형과 큰 차이를 보이지 않는 나머지 유전자에 대해 PCR 산물에 대한 염기서열을 확인한 결과, W-4는 MYB 유전자의 세번째 exon에서 각각 6bp와 19bp의 염기서열이 삭제된 myb1-1 대립형질(Chang et al., 2005)을 내재하고 있는 것으로 확인되었다. 특히, W-4 에서 안토시아닌 생합성 유전자의 전사산물의 축적이 감소하였는데(Fig. 3A). 이는 I. nil의 MYB 유전자의 돌연변이종인 c1에서의 결과와도 유사하였으며(Morita et al., 2006), KK-1과 달리 W-4계통의 흰 화색은 myb1-1 대립형질에 의한 것으로 판단된다. KK-1은 적색계로 F3'H 유전자 내부에 En/Spm의 Tip201 비자율성 전이인자가 삽입되어 F3'H 발현이 중단된 pink 형질이 내재되어 있는데(Fig. 2C; Hoshino et al., 2003), W-4에서도 동일한 pink 형질의 존재가 확인되어 F₂ 검정에서 적색계가 분리된 결과와 일치하였다(Fig. 3B).

Fig. 3. Molecular characterization of the KK-1 and W-4 mutants. Northern blot analysis of genes related to the anthocyanin biosynthetic pathway (A). Total RNAs (10mg) of flower buds were separated and hybridized with cDNA probes indicated. RT-PCR analysis of regulatory genes and the F3'H gene (B). PCR primers and condition are indicated in Table 2.

Table 1. Regulatory proteins related to pigmentation of flower anthocyanin and seed color.

 RT-PCR 결과에서 두 변이체는 bHLH2 유전자의 전사산물의 크기 및 축적양에 차이를 보였다(Fig. 3B). 따라서, bHLH2 유전자좌의 돌연변이유무를 확인하기 위해 Southern blot 분석을 수행하였다(Fig. 4A). I.purpurea의 게놈에는 bHLH2 유전자가 한 copy 존재하며, 두 변이종의 bHLH2는 야생형인 FP39와 다른 크기를 보였다. FP39에 비해 KK-1은 약 8 kb가 컸으며(ScaI), W-4의 경우XbaI 절단에서 약 3.5 kb가 작은 것으로 나타났다. 이는 최근 Park et al.(2007)이 보고한 bHLH2 대립형질 가운데 가변성 형질인 ivsm1, 그리고 안정화된 형질인 ivs-stb 와 각각 유사하며, KK-1이 가변성 대립형질 그리고 W-4 가 안정화된 대립형질을 내재하고 있을 것으로 추측되었다. ivs-m1은 자율성 전이인자 Tip100이 삽입되어 있고, ivs-stb는 약 830 bp 전후의 Mutator(Mu) type의 비자율성 전이인자가 삽입되어 있으며, 이 두 형질은I. purpurea의 화색 및 종자색 변이를 유발하는 bHLH2 유전자의 대립형질이었다(Park et al., 2007). 따라서 이들 대립형질과 동일한 형질인가를 확인하기 위해 이들 전이인자의 삽입을 확인할 수 있는 특이적 PCR을 수행하였다. Tip100의 확인을 위해 forward primer로 ItM-F17과 IpM-F5를 그리고 reverse primer로는 Tip100의 5’ 영역에 위치한 YCHSD-9LA를 사용하여 PCR을 수행하였고, Mu type의 전이인자를 확인하기 위해서는 forward primer로 ItM-F17과 ItM-F3를, reverse primer로는 IpM-R8과 ItM-R23를 사용하여 PCR을 수행하였다(Figs 4C and 5A; Table 2). KK-1에서는 Tip100에서 유래한 PCR 산물이 증폭되었으며 W-4에서는 야생형인 FP39에 비해 약830 bp 전후의 Mu type의 전이인자를 포함한 크기의 PCR 산물이 각각 증폭되어 두 변이종의 bHLH2 대립형질은 ivs-m1과 ivs-stb일것으로 판단되었다. ivs-m1과 ivs-stb 의 발현정도를 Northern blot으로 분석한 결과, 두 변이종의 bHLH2 전사산물 축적이 FP39에 비해 현저히 감소됨을 확인할 수 있었는데(Fig. 4B, Full), 이전 보고된 ivs-m1과 ivs-stb 돌연변이형질의 결과와 유사하였다(Park et al., 2007). 따라서 ivs-m1과 ivs-stb 대립형질이 KK-1과 W-4 계통의 화색 및 종자색 변이의 주 원인임을 확인할 수 있었다. 두 대립형질에 삽이되어 있는 전이인자가 bHLH2 유전자의 전사에 미치는 영향을 검토하기 위해 Fig. 5A에 나타낸 것과 같이 3종의 probe를 제작하여 Northern blot 분석을 실시하였다. Fig. 5A와 같이 ivs-m1은 두번째 intron과 7번째 exon에 Tip100이 삽입되어 있고, ivs-stb는 두번째 exon과 5번째 intron에 IpMu1과 IpMu2가 각각 삽입되어 있는데, KK-1의 경우 3’ 영역의 probe에서 그리고 W-4의 경우는 5’ 영역부터 전산산물의 축적이 급격히 떨어져 두 형질 모두 exon에 삽입된 전이인자가 결정적일 것으로 판단되어 좀 더 정밀한 검토를 위해 RT-PCR을 실시하였다(Figs. 4D and 5A). 예상했던 바와 같이, 두 allele 모두 exon 영역에 삽입된 부위의 3’ 영역에서 급격히 PCR 산물의 양이 줄어 드는 것을 확인할수 있었는데, exon영역의 삽입이 결정적 영향을 미친것으로 사료된다. ivs-m1과 ivs-stb 형질의 DNA 염기서열을 분석한 결과 삽입된 전이인자를 제외하더라도 단백질을 암호화하고 있는 exon영역에서 26 부분 그리고 intron 영역에서165부분에서 염기서열 차이를 보였다(Fig. 5B). ivs-m1은 Tip100을 제외하면 exon 영역에서 FP39와 100% 염기서열이 일치한 반면, ivsstb의 경우는 exon 26부분의 염기서열 차이가 14아미노산 차이로 나타났지만(Fig. 5C), 두번째 exon에서 IpMu1이 제거될 경우 정상적인 유전자로써 기능하는것으로 보고되었다(Park et al., 2007). 따라서, ivs-stb와FP39 계통의 ivs-m1은 종내 서로 다른 ecotype의 대립형질로 진화한 것으로 추정된다.

Fig. 4. Molecular analyses for the ItIVS gene. Southern blot (A) and northern blot (B) analyses. Genomic DNAs (10mg) cleaved with ScaI and XbaI, were separated and hybridized with a probe (full) of the IVS cDNA (A). Total RNAs (10 mg) of flower buds were separated and hybridized with probes (full, 5’, middle and 3’) of the IVS cDNA (B). All probes are indicated in Fig. 5A. PCR (C) and RT-PCR (D) analyses. Primer sets for each PCR fragments were indicated in Table 2 and Fig. 5A, and a IpMYC3-5’ primer in Table 2 was used as the forward primer for amplification of all fragments in (D).

Table 2. Primers used for PCR.

Fig. 5. Molecular characteristics of the IVS alleles. Structure of the IVS gene (A). The white, gray, and black segments within exon boxes indicate the untranslated, coding, and bHLH-domain regions, respectively. Transposable elements are not represented by scale. The segments used for probes full, 5’, middle and 3’ for molecular hybridization in Fig. 4 are indicated by dotted lines below the map. Primers of PCR or RT-PCR for the IVS gene in Fig. 3 and Fig. 4 were represented as arrowheads. Sequence alteration of DNA (B) and amino acid (C) in the IVS coding region. Numbers in (C) indicates amino acid (a. a.) number from methionin (ATG), and amino acids of ivs-m1are exactly identical to those of wild type allele.