서 언

Phalaenopsis의 화경 발생을 결정하는 주요 요인은 온 도이며, 20℃ ~ 25℃의 온도 조건 에서 30일 이상 재배 하면 화경이 발생된다(Blanchard and Runkle 2006; Lopez and Runkle 2005). 그러나, Phalaenopsis는 품종 에 따라 화경 유도에 필요한 저온 요구도가 상이하며 (Newton and Runkle 2009), 일부 품종에서는 저온 환경 에 적응하여 화경이 발생하지 않거나 화경 유도를 위한 저온처리 상당기간 길어지는 문제들이 종종 발생한다. Phalaenopsis 재배 농가는 절화 생산을 위해서 1차 화경 을 수확 후에 2차 화경을 유도하기 위해서 28℃ 이상 으로 2 ~ 3개월 고온으로 재배한 후, 다시 저온처리를 실 시하여 화경을 유도하고 있다. 이 경우 2차 화경을 유 도하는데 최소 3 ~ 5개월의 장기간이 소요된다. 식물이 주 위 온도를 감지하는 방법은 온도감지 센서를 내부에 따 로 가지고 있는 것이 아니라 원형질막의 유동성, 단백질 의 구조, 세포골격 및 광합성 대사반응 그리고 세포질 내 칼슘 농도 변화를 통해 주위 온도를 감지한다고 알려져 있다(Eric and Zachowski 2010). 특히, 그 중에서 세포 질 내 칼슘 농도는 외부 온도조건 변화에 따라 민감하 게 변하는데(Penfield 2008), 칼슘은 체내에서 식물의 여 러 가지 생리반응을 유도시키는 2차신호 전달자의 역 할을 수행하며 다양한 유전자의 발현에 작용한다(Bush 1995; Reddy et al. 2011). 최근 국내의 Phalaenopsis에 대한 온도와 관련한 연구는 화아 분화와 개화를 위한 자 연 냉풍처리방법(Chae 2008), 냉방처리시 당밀 처리가 개화에 미치는 영향(Lee and Kim 2012) 등과 Lee et al.(2011)이 하계 고온기 근권 냉방이 화경 발생을 유도 하지 못한다고 하여 Phalaenopsis의 화경 발생에 필요한 저 온을 감지하는 부위에 대한 연구는 수행된 바 있으나, Phalaenopsis의 저온감응 기작에 관한 연구는 아직까지 미 흡한 실정이다. 이에 Phalaenopsis 2차 화경 발생을 안정 적으로 유도하고, 2차 화경유도 기간을 단축시킬 수 있는 저온처리 기술을 개발하고, 그에 따른 Phalaenopsis의 세 포질 내 칼슘 농도의 변화를 알아보기 위해 시험을 수 행하였다.

재료 및 방법

주간의 변온 저온 처리가 팔레놉시스의 화경 발생에 미치는 영향

Phalaenopsis의 화경 발생은 품종에 따라 온도 처리에 대한 반응이 틀릴 뿐만 아니라 온도 처리시기 이전의 화 경 존재 유무에 의해서도 2차 화경의 발생이 영향을 받 는다. 주간의 변온 저온 처리가 Phalaenopsis의 화경 발 생에 미치는 영향에 대하여 알아 보고자 2010년 8월 19일부터 2010년 11월 2일까지 시험을 수행하였다. 시험 재료는 묘령이 기외에서 순화된지 각각 36개월과 15개 월이 지났으며, 1차 화경이 발생되어 있는 생식생장 상 태의 Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’, Phalaenopsis ‘Hinamatsuri’와 실험 당시 화경이 발생되지 않았던 영 양생장 상태의 12개월 묘령의 미개화주 Phalaenopsis ‘Hinamatsuri’를 사용하였다. 화경이 발생하지 않은 영양 생장 상태의 미개화주는 28℃ 이상의 온도에서 재배되던 개체를 사용하였으며, 화경이 발생된 개체들은 24℃에서 생육시키던 개체를 처리 직전에 1차 화경을 제거한 후 바 로 시험에 사용하였다. 시험은 메탈할라이드등(MH 250W, City Co. Ltd, Korea)과 고압나트륨등(HPS 400W, Dong sung Co. Ltd, Korea)을 광원으로 사용한 식물생장상 내 에서 실시하였으며 환경은 주•야간 일장을 각각 14시간 과 10시간, 광도는 150μmol • m⁻² • s⁻¹, 습도는 60%로 조절 하였다. 온도 처리는 25℃와 20℃를 2시간씩 교대로 주간 14시간 동안 처리한 주간변온 처리[25-20 ALT, alternating low temperature]와 주간 14시간 동안 25℃로 처리한 주간 항온 처리[25 CLT, constant low temperature]를 두었으며 두 처리 모두 야간 온도를 10시간 동안 20℃로 처리하 였다.

주간 변온 처리에 의한 화경 발생 촉진 효과의 원인

주간 변온 처리에 의한 화경 발생 촉진 효과가 변온 자체에 의한 효과인지 상대적으로 낮은 온도 조건에 의 한 효과인지 알아보기 위하여 2010년 11월 23일부터 2011년 1월 19일까지 시험을 수행하였다. 기외에서 18개 월 생육된 Phalaenopsis ‘Hinamatsuri’ 개화주를 처리 직 전에 화경을 제거하여 사용하였다. 시험은 메탈할라이드 등과 고압 나트륨등을 사용한 생장상 내에서 수행하였 으며, 주간 16시간, 야간 8시간의 일장, 광도 150μmol • m⁻² • s⁻¹, 습도는 60%로 환경을 조절하였다. 온도 처리 는 주간 16시간 동안 22.5℃(22.5 CLT)로 처리 한 주간 항온 처리와 25℃와 20℃를 2시간씩 교대로 주간 16시 간 동안 처리한 주간 변온 처리(25-20 ALT)를 두었으며, 두 처리 모두 야간 온도는 20℃로 조절하였다.

주간 온도 조건에 따른 2차 화경 발생과, 엽내 Calcium dependent protein kinase(CDPK) gene 발현

2012년 7월 6일부터 8월 24일까지 시험을 수행하였다. 시험에 사용된 재료는 생체중 82g 크기의 영양생장 단 계인 Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’ 생체중 172g 크기의 Phalaenopsis ‘Grace’ 개화주를 사용하였다. 두 품 종을 각각 주간항온 처리는 주간과 야간에 각각 30℃(1 시간)/20℃(10시간), 25℃(14시간)/20℃(10시간) 그리고 주 간변온 처리는 25℃와 20℃를 14시간 동안 2시간씩 교대 로 25 ~ 20℃(14시간) /20℃(10시간)가 되도록 조절하였다. 시험은 메탈할라이드등과 고압나트륨등을 사용하여 광 도를 100μmol • m⁻² • s⁻¹로 유지한 생육 상에서 수행하 였다. Phalaenopsis ‘Grace’ 개화주는 24개체, Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’는 56개체씩 처리하였다. Calcium dependent protein kinase(CDPK) gene의 발현을 알아보기 위해 Real-time PCR분석을 실시하였다. RNA 추출은 Trizol(Invitrogen)을 이용하여 Phalaenopsis 엽조직 으로부터 추출하였다. 추출한 RNA 10ug에 DNaseI(TaKaRa)을 처리 한 후 PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa)를 이용하여 제조사 지침에 따라 cDNA를 합성했다. Real-time PCR 분석은 상기에서 기술한 바와 같이 합성된 cDNA를 사 용하여 two-step qPCR을 수행했고, 기기는 CFX96 (BioRad)를 사용하였다. 증폭 반응은 총량 20μl에 10μl 2x SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa), 2μl primer(500nM), 2ul cDNA를 혼합하여 최초 95℃에서 10초간 반응 시 키 고, 95℃에서 5초와 60℃에서 30초의 cycle 을 45회하여 각 sample당 3회 반복으로 qPCR을 수행하였다. 각 계 통의 CDPK 상대적 발현량 분석을 위하여 2^-ΔΔCt method(Livak and Schmittgen 2001)를 사용하여 분석하 였다.

통계분석

통계분석은 SAS 프로그램(SAS 9.1, SAS Institute Inc., USA)을 이용하여 던컨의 다중 범위검정으로 분석 하였다.

결과 및 고찰

주간의 변온 저온 처리가 Phalaenopsis의 화경 발 생에 미치는 영향

Phalaenopsis의 화경 발생 유도를 위해 주간의 온도를 14시간 동안 25℃와 20℃를 반복적으로 번갈아 2시간씩 변온 처리해 준 결과, Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’의 경우 화경 발생 소요일수가 변온 처리가 45일로 60일이 소 요되었던 항온처리보다 15일 단축되었다. Phalaenopsis ‘Hinamatsuri’ 품종은 변온 처리에서 개화주와 미개화주 모 두 처리 50일 후 화경이 발생되었지만, 항온 처리에서는 개화주는 96일, 미개화주는 75일로 화경이 발생되었던 개 화주에서 화경 발생이 늦어졌다(Table 1). 변온 처리에서 는 화경 발생 소요일수가 품종간에 차이가 없었으나 항 온처리에서는 Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’ 품종의 화경이 Phalaenopsis ‘Hinamatsuri’ 품종보다 36일 빨리 발생되었다. 그리고 Phalaenopsis ‘Hinamatsuri’ 품종의 경우 미개화주의 화경이 1차 화경을 제거한 후 바로 저 온처리를 했던 개화주 보다 21일 가량 빨리 발생되었다. 즉 1차 화경을 수확한 후 곧 바로 저온처리를 계속 하 면 화경이 연이어 발생은 되나 미개화주보다 화경의 발 생이 21일 이상 늦어짐을 알 수 있었다. 즉, 본 시험 결 과 팔레놉시스의 1차 화경을 제거한 후 2차 화경 발생 을 위해 고온처리 기간 없이 곧 바로 저온처리를 지속 해도 항온과 변온처리 모두 2차 화경은 발생되나, 변온 처리가 항온처리보다 2차 화경을 단기간에 유도할 수 있 음을 알 수 있었다. 항온처리에서는 미개화주가 개화주 보다 화경 발생 소요일수가 짧은 것을 알 수 있었다.Phalaenopsis의 화경과 잎 간에는 source와 sink의 관계 가 있다고 보고된 바 있으며, 식물체 전체 당 함량이 높 았던 개체에서 화경 발생율이 높았고, 엽내 starch 함량 증가와 더불어 소화수가 증가한다고 보고된 바 있다(Endo et al. 1992; Kubota and Yoneda 1993). 즉, 본 시험의 항온처리에서 개화주의 화경 발생 소요일수가 미개화주 보다 길었던 것은 개화주의 경우 화경이 한번 발생됨으 로 인해 미개화주보다 체내의 양분, 특히 당 성분의 소 모가 많음으로 인해 2차 화경의 발생이 늦어진 것으로 판단된다. Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’ 개화주가 Phalaenopsis ‘Hinamatsuri’ 개화주보다 화경 발생이 빨랐던 것은 품종의 차이는 있으나, Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’ 품종이 30개월로 15개월 묘였던 ‘Hinamatsuri’ 품종 보다 묘령이 15개월 가량 많았던 결과인 것으로 판단된다.

팔레놉시스의 화경 발생에 미치는 온도의 영향에 대해 서 주• 야간 온도 조건에 따른 화경 발생(Kubota and Yoneda 1993), 주년 개화를 위한 저온처리 방법(Hirai and Mori 1997), 묘령에 따른 일장과 온도에 대한 개화 반응(Yoneda et al. 1991) 등이 있었다. 그러나 대부분 주간 및 야간 동안 정해진 항온조건 따른 개화반응을 연 구하였으며, 주간의 변온처리에 의한 화경유도에 관한 시 험은 현재까지 없었다. 세포질내 칼슘의 농도는 저온이 나 광, 병충해에 의한 피해(Tsai et al, 2007)등과 같은 다양한 환경조건에 의해서 영향을 받으며, 자극에 의해 세포질내로 유입되는 칼슘으로 인한 경우도 있으나, 과 도한 저온에 의해 세포막의 구조가 변하여 외부에서 유 입된 칼슘으로 인해 농도가 높아지기도 한다(Wood et al. 1984). 일정한 패턴으로 반복적으로 나타나는 세포질 내 Ca 농도의 변화는 기공 개폐와 같은 식물의 특정 반응 을 유도한다(McAinsh et al. 1995). 한편, Ca의 이동은 BAPTA와 같은 Ca과 결합하여 이동을 억제하는 물질을 처리할 경우 저온이 주어져도 세포질내 Ca의 농도 변화 는 없다고 보고되어 있어(Monory and Dhindsa 1995) 저온과 Ca의 이동과는 직접적 연관성이 널리 보고되어 있다. Phalaenopsis 화경을 유도 하는 저온조건 내에서 변온 처리를 실시할 경우 세포질 내 칼슘 농도의 변화 패턴을 만들어내게 되고 그로 인해 Phalaenopsis의 화경 발생이 촉진되리라 판단하였다. 이에 다음의 시험을 수 행하게 되었으며, 예상에 상당한 결과를 얻을 수 있었다.

주간변온 처리에 의한 화경발생 촉진 효과 원인

25-20℃ 변온 처리의 경우 주간의 평균 온도가 22.5℃ 로 항온 처리의 25℃보다 낮은 조건이 된다. 이에 변온 처리의 효과가 변온 조건에 의한 효과인지 아니면 25℃ 처리보다 상대적으로 낮은 주간의 저온 조건에 의한 효 과인지를 밝히기 위해, 주간의 평균 온도가 같도록 변온 과 항온 처리를 하여 시험을 수행하였다. 그 결과, 25- 20℃의 변온 처리에서 주간 22.5℃ 항온 처리보다 약 21일 가량 화경이 빠르게 발생되었다(Fig. 1). 즉, 위의 두 시험 결과를 종합해보면 Phalaenopsis의 화경 발생 소 요일수는 주간의 변온 조건에 의해 단축 될 수 있으며, 이 결과는 25℃에서 20℃로의 변온 자극에 의한 결과로 판단 된다.

주간 온도 조건에 따른 2차 화경 발생과, 엽내 Calcium dependent protein kinase(CDPK) gene 발현

변온처리에 의해 화경 발생 소요기간이 단축된 원인이 세포질 내 칼슘 농도의 변화와 관련이 있는지 알아보 기 위해, 변온과 항온 처리에 따른 화경 발생과 엽 세 포질내 칼슘 농도를 Calcium dependent protein kinase (CDPK) gene의 발현을 조사하였다. Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’의 경우 30℃ 항온처리에서는 화경이 전혀 발 생되지 않았으며, 25℃ 항온처리에서는 전체 54개체중 4개 만 화경이 발생되었고, 변온처리 에서는 21개 발생하였다. 품종은 틀리나 상대적으로 묘령이 길었던 Phalaenopsis ‘Grace’ 품종에서도 30℃ 항온 처리는 화경이 전혀 발생 되지 않았으며, 25℃ 항온 처리에서는 25개체 중 11개 가 발생되었고, 25 ~ 20℃ 변온처리에서는 25개체 중 24개가 발생하였다(Fig. 3). 온도처리 조건에 따른 엽내 PaCDPK1 유전자의 발현을 조사한 결과 온도 처리간에 발현의 차이를 확인 할 수 있었다(Fig. 3). Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’의 경우 30℃ 주간 항온 처리보다 25 ~ 20℃의 주간 변온 저온 처리와 25℃의 주간 항온 저온처리에서 PaCDPK1 유전자 발현이 높게 나타났으며, Phalaenopsis ‘Grace’의 경우 화경 발생이 가장 많았던 25 ~ 20℃의 주간 변온 저온처리에서 PaCDPK1 유전 자 발현이 3배 이상 높게 나타났다. Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’에서 화경이 발생 되지 않았던 30℃ 처리 보다 화경이 발생되었던 25℃ 항온과 25 ~ 20℃ 변온처 리에서 PaCDPK1 유전자 발현이 높게 나타났다. 그리고 Phalaenopsis ‘Grace’ 변온처리에서 PaCDPK1 유전자 발 현이 다른 처리보다 3배이상 높았다. 이러한 결과를 고 려해보면, Phalaenopsis의 화경 발생을 위한 저온 감응 기작에 세포질 내 Ca의 농도 변화가 관여를 하는 것으 로 판단된다. Tsai et al.(2007)은 팔레놉시스의 세포질내 Ca 함량이 저온, 상처 및 병해충의 감염에 의해 증가하 며, 특히 온도와 관련하여 28℃ 이상의 온도 조건보다 4℃의 저온조건에서 발현이 증가한다고 보고한바 있다. Eric and Zachowski(2010)는 세포질 내 Ca 농도 변화가 온도 센서의 역할을 한다고 보고한 바 있다. 즉, Ca은 건조, 병충해 침입, 염 스트레스뿐만 아니라 저온의 신 호를 생체내로 전달하는 2차 신호 전달자로 잘 알려져 있으며(Harsh 2003), 특히 주위 온도 변화에 반응하여 세 포질 내의 Ca 농도가 민감하게 변하는 것으로 보고되어 있다(Nagel-Volkmann et al. 2009). 세포질 내의 Ca은 저온에 의해 농도가 증가하였다가 다시 감소하며, 한번 증가한 세포질 내 Ca 농도가 외부 조건에 의해 다시 증 가하기 위해서는 장기간 동안 안정적 상태가 유지 된 이 후 다시 자극이 주어지거나 이전보다 더 큰 온도의 자 극이 주어져야 증가하는 것으로 알려져 있다(Plieth et al. 1999). 이러한 세포질 내 Ca의 농도의 주기적인 변화는 세포내에서 특정 유전자의 발현을 유도한다(Ricardo et al. 1998). 즉 본 시험 연구를 종합해 볼 때 Phalaenopsis의 화 경 발생과 세포질 내 Ca의 농도 변화와 관계가 있을 것 으로 판단되며, 변온처리에 의한 세포질 내 Ca 농도의 변화가 이러한 결과를 유도한 것으로 판단된다. 앞으로 저온의 온도 범위와, 저온경과 시간에 따른 팔레놉시스 의 엽 세포질 내 Ca 농도의 주기적인 변화와 화경 발 생간의 관계에 대한 기초 연구가 필요할 것이다.2

초 록

주간의 저온처리 방법이 팔레놉시스의 화경 발생과 엽 의 세포질 내 칼슘 농도 변화에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 주간 25℃의 항온저온 처리보다, 25 ~ 20℃ 의 변온 처리가 화경 발생을 2주일 가량 단축시켰다. 그 원인은 주간의 평균 저온 때문이 아니라 변온처리 그 자 체의 효과 때문이었다. 저온 처리에 의한 엽의 세포질 내 Ca농도 증가 를 조사하기 위하여 PaCDPK1 유전자 발현 을 측정하였다. 화경 유도를 억제시키는 30℃ 고온처리에 서의 PaCDPK1 유전자 발현은 25℃와 25 ~ 20℃ 처리보 다 낮았다. 특히, PaCDPK1 유전자의 발현은 25 ~ 20℃ 의 변온 저온 처리에서 다른 처리들 보다 3배 이상 높 았다. 이러한 결과들은 화경 발생 소요일수가 변온 저온 처리에 의해서 단축될 수 있으며, 화경 발생 소요일수의 단축은 세포질 내 Ca 농도의 변화와 관련이 있음을 말 해주고 있다.

추가 주요어:

칼슘, 유전자 발현, 화경 , 효소, 저온, 단백질