서 언

국화는 1800년대를 전후하여 중국, 한국, 일본을 거쳐 유럽, 미국 등으로 전파된 전세계 대중들에게 친근한 화 훼작물이다. 우리나라의 절화 국화 재배면적은 95년 이 후 지속적으로 증가하여 2006년에는 재배면적이 805ha 로(MIFAFF 2006) 정점에 이르렀고 이후 지속적으로 감 소하고 있지만, 절화류 중에서는 2012년기준으로 판매액 이 장미에 이어 두 번째로 많은 705억원으로 국내 화훼 작물 중 큰 비중을 차지하고 있다(MIFAFF 2012). 뿐만 아니라 국화 수출은 주로 일본이 주 대상국인데 2011년 에는 수출액이 2001년대비 약 1.9배 증가한 13,802천불 을 기록한 주요 수출품목이었다(MIFAFF 2012). 하지만 최근 들어 국화 재배면적, 생산량과 수출이 감소 추세에 있는 데 이는 중국에서의 저가 국화 유입 및 국내 생산 단가 상승으로 인한 수출물량 생산 감소 등이 원인으로 작용하였다. 또한 말레이시아, 중국 등 경쟁국들이 일본 에 수입되는 물량의 비중을 높여가고 있기에 우리나라 수 출 농가가 어려움을 겪고 있다. 따라서 이러한 어려움을 극복하기 위해서는 국내 소비자와 수출국의 기호 성향이 반영된 고품질 절화류 품종 개발이 필요하다. 국화품질 의 기준은 국화 종류에 따라 약간의 차이는 있지만, 공 통적으로 적용되는 것 중에 하나가 병충해 여부이다(Yoo and Roh 2012). 국화병충해는 국내 출하에서 품질저하 뿐만 아니라 해외수출 확대에도 걸림돌이 되고 있다. 국 내에서는 국화흰녹병이 가장 심각한 피해를 주는 병해 중 하나이다. 국화흰녹병은 1895년 일본에서 세계적으로 처 음 발견된(Hennings 1901; Hiratsuka 1957) 이후 중국과 남아프리카로 전파되었다(Priest 1995). 1963년이후에는 영 국을 포함한 유럽 여러국가에서 발견된 바 있고(Baker 1967) 현재는 국화를 재배하는 모든 지역에서 흰녹병 이 발생하고 있는 실정이다(Anon 1989; Punithalingam 1968). 현재 국가간 엄격한 이동 규제에도 불구하고 지 속적으로 발생되고 있다. 우리나라에서는 현재까지 매년 전국적으로 국화재배지에서 발생하고 있다. 특히 환경조 절이 어려운 비닐하우스 위주의 재배방법을 채택하고 있 어 일교차가 큰 봄, 가을에 주로 많이 발생하고 있으며 특히 5월달에 가장 많이 발생한다(Koo 1996). 국화흰녹 병은 일단 발병하면 병원균의 특성상 단시간내에 비닐하 우스 전체를 감염시키기 때문에 화학적 농약방제에 어려 움이 있으며, 또한 치료제 농약이 고가이기 때문에 비용 에 대한 부담도 있다. 현재 비용을 최소화할 수 있는 방 법은 비닐하우스의 습도를 80% 이하로 조절하고 병 발 생을 지속적으로 모니터링하여 전염원을 조기에 재배지 에서 제거하는 것이다. 하지만 이러한 방법은 많은 노동 과 시간이 필요로 하고 병 발생을 근절하기에 한계점이 있다. 근본적인 해결책은 저항성 품종 개발이지만 이는 많은 시간이 필요하기에 단기적 방법으로 육안으로 병반 을 확인하기 이전에 국화흰녹병 감염여부를 검정할 수 있 는 기술을 개발한다면 좀더 효율적이고 효과적으로 병 발 생을 최소화할 수 있을 것이다. 따라서 본 연구는 국화 흰녹병균을 진단하기 위해 연중 실험실내에서 이병주를 생산하는 기술을 확립하고, 국화에서 발병되는 곰팡이 병 원균 중에서 국화흰녹병균만을 선별하는 유전자를 선발 하는 한편, Real-time PCR 방법을 이용하여 국화흰녹병 균 검출 한계 농도를 조사하고자 수행하였다.

재료 및 방법

국화흰녹병균 접종 및 병 발생

국화흰녹병균의 이병주는 구미시설공단으로부터 분양받 은 국화흰녹병에 감수성인 노아품종을 사용하였다. 분양 받은 기주식물체(노아 품종)는 삽목을 통해 번식시켜 접 종에 사용하였다. 새순을 잘라 삽목하고 2주간 23℃에서 삽수가 마르지 않게 수분을 조절하여 뿌리가 활착된 후 화분으로 옮겨 2주간 온실에서 키운 후 접종 식물체로 사용하였다. 국화흰녹병 병징이 육안으로 확인된 후 2주 일 경과된 이병주를 접종원으로 사용하였다. 병원균의 접 종을 위해 이병잎의 병반을 중심으로 충분히 스프레이 한 다음, 상대습도가 90% 이상인 23℃ 암상태(Takatsu 2000) 에서 접종 후 0시간, 12시간, 24시간, 48시간, 7일을 유 지함으로써 병원균이 식물체에 침입하는데 필요한 최적 의 환경상태를 확인하고자 하였다. 병원균이 접종된 식 물체는 접종상에서 증식 생장상으로 이동시켜 병원균이 증식하도록 23℃, 16시간 광조건의 식물생장상에서 4주 간 배양하였다.

국화흰녹병균 포자형태 관찰

국화흰녹병 병징을 보이는 병원균 담자포자의 형태는 De Backer(2011) 등의 방법을 약간 변형하여 관찰하 였다. 우선, 페트리디쉬 뚜껑에 이병잎을 고정하고 담자 포자 형성을 위해 증류수가 흐르지 않을 정도로 스프레이 하여 담자포자 형성에 적합한 수분 상태를 유지하였다. 페 트리디쉬 바닥면에는 증류수를 붓고 이병잎 바로 밑에 현 미경 관찰용 슬라이드글라스를 위치시켜 포자를 수집하 였다(Fig. 2). 23℃의 암 상태에서 24시간 경과 후에 슬 라이드 글라스에 떨어진 포자를 면도칼로 회수한 후 400X 배율에서 현미경(Carl Zeiss DE/AXIO)으로 관찰하였다.

PCR 분석용 국화병원균 및 게놈 DNA 분리

구미시설공단에서 분양받은 이병주에서 분리한 국화흰 녹병균을 공시균주로 이용하였다. 그밖에 창원, 보령, 무 안 국화 시설재배지에서 발병된 이병주로부터 분리한 국 화흰녹병균도 공시균주로 사용하였으며, 기타 국화에서 발 병되는 5종의 병원균은 농촌진흥청 농업미생물은행(KACC) 으로부터 분양받아 사용하였다(Table 1). 국화흰녹병균의 게놈 DNA 분리용 시료는 접종 후 4주일간 경과된 이 병잎에 있는 균사체를 날카로운 면도칼로 잎에서 분리하 여 초저온냉동건조 후 사용하였다. 게놈 DNA 분리는 NucleoSpin plant kit(Macherey-Nagel products)의 곰팡 이병원균 게놈 DNA 분리 방법에 따라 수행하였다.

국화흰녹병균 ITS 및 국화흰녹병균 특이 유전자 PCR 증폭

국화흰녹병균 ITS(Internal Transcribed Spacer), 국화 ITS 에 대한 PCR 증폭은 Pedley(2009) 가 사용한 프라이머, 5’- TGCATGAATTTTTGAAAGGT-3’(PhrF), 5’-CAAAAATTA TTTTGTGAGAGGG-3’(PhrR)를 사용하였으며, 국화 프라이 머는 ITS 5’-GTCGATGCGCATTTAC TCGA-3’(CmF), 5’- TTCGGCCAACCACGCCATGA-3’(CmR)이었다. 국화흰녹병 균 특이 검정 프라이머는 국립농업과학원 유전체과에서 진 행중인 국화흰녹병균 유전체 정보 결과를 활용하여 선발 한 5’-GGGATTCAATGGC GAA-3’(PhRTF), 5’-GAGGGT GGGTTTTGAGA-3’(PhRTR)를 사용하였다. ITS 및 국화 흰녹병균 특이적 검정용 PCR 증폭에 사용된 template DNA은 10ng을 사용하였으며, 국화흰녹병균 게놈 DNA 량의 검출 한계 농도조사에서는 template DNA량을 10ng 에서 시작하여 1/2배씩 희석하여 0.25ng까지의 게놈DNA 를 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 2분, 94℃에서 30초, 60 ~ 65℃에서 30초(ITS 60℃, 병원균 특이 검정 65℃), 72℃에서 1분간으로 구성된 반응을 30회 반복하였 으며, 마지막 신장 반응은 72℃에서 10분간 진행하였다. PhrF-PhrR 프라이머 조합으로 증폭된 DNA는 pTOP BluntV2(Enzynomics products) 벡터로 클로닝한 후 M13 forward, reverse 프라이머를 이용하여 클로닝된 DNA 염 기서열을 분석하였다.

Taqman real-time PCR

Taqman real-time PCR probe는 5’-CGCGACTTGTC TCATCAAAC-3’(PhTRT)이며, 5’에는 Texas Red를 3’에 는 matching black hole quencher(BHQ2)의 두개의 형광 염색시약을 사용하였다. pTOP BluntV2벡터에 PhRTFPhRTR의 PCR 프라이머 조합으로 증폭된 182bp가 삽입 된 재조합DNA(T-Ph182 명명)는 10¹⁰~ 10²(재조합 DNA copy 수)까지 10배씩 희석하여 Crossing point(CP) value 와 유전자 copy 수의 연관관계를 조사하고 template DNA로 사용하였다. 국화흰녹병균 게놈 DNA와 CP value 사이의 상관관계를 조사하기 위해 게놈 DNA 40ng에서 6pg까지를 template DNA로 사용하였다. Real time PCR 반응은 95℃에서 4.5분간 반응 후, 95℃에서 15초, 65℃에서 15초 반응을 40 cycle 진행하였으며, 각 희 석 배수에 해당하는 template DNA를 3반복으로 Light Cycler 480 II(Roche, Germany)기기로 DNA를 증폭하 였다.

결과 및 고찰

국화흰녹병 이병주 생산

국화흰녹병 검정 기술 개발과 병저항성 유전자 발굴 연 구 등의 기반연구를 지속적으로 수행하기 위해서는 이병 주의 연중 생산이 필수적이므로 실험실 조건에서 이병주 생산 시스템을 우선적으로 확립하였다. 국화흰녹병균이 식 물체를 침입하는 최적의 환경조건은 상대습도가 90%이 상인 23℃ 암상태인 것으로 알려져 있어(Ohishi et al. 2000), 접종 후 23℃와 90% 이상의 상대습도 조건에서 유지되는 기간과 감염정도의 상관관계를 조사하였다. 접 종 직후 접종 식물체를 국화흰녹병원균 증식 식물 생장 상으로 이동한 것과 접종 후 각각 12시간, 48시간, 7일 후 이동한 것들 간에는 위에서 언급된 환경 조건에서 머 물러 있는 기간과 관계없이 거의 유사한 병원균 감염정 도를 나타내었다(Fig. 1). Ohishi et al.(2000)은 병원균 접종시 암상태를 처리하였는데, 본 연구결과에서도 접종 한 병원균이 식물체에 침입하는 데 광이 필요하지 않음 을 확인하였다. 광이 동포자 또는 담자포자의 발아에 영 향을 주지 않는다는 Firman and Martin(1968)의 연구결 과와 동포자 발아에는 광이 부정적 영향을 주지만, 담자 포자 발아에는 영향을 주지 않는다는 Yamada(1956)의 연 구결과 등이 본 연구결과와 일치하였다. 병반의 형태는 병원균 접종 후 식물체를 식물 생육상으로 옮긴 후 6 ~ 7일에 잎의 뒷면에서 흰색의 부풀어 오른 돌기로 육 안으로 관찰되었으며 이후 잎표면에 흰색의 반점을 확인 할 수 있었다. 14일 후에는 잎의 표면에 있는 병반 부분 이 함몰되기 시작하였고 21일 이후에는 잎의 뒷면 균사 체 색깔이 초기의 흰색에서 황색으로 변하였다. 국화흰 녹병의 병징을 나타내는 병반의 균사체에서 형성된 담 자포자의 크기는 13 ~ 14μm로 측정되어 이전에 발표한 7 ~ 14μm (Baker 1967; Hennings 1901; Kapooria and Zadoks 1973; Punithalingam 1968)의 범위 내에 있는 것 으로 확인되었다. 반면에 균사체 덩어리를 잎에서 분리한 후 물에 현탁하여 현미경으로 관찰할 때 담자포자는 거의 발견되지 않고 균사체에서 발아된 동포자만을 확인할 수 있었다.

국화흰녹병균 검정용 PCR, Real-time PCR

구미시설공단에서 분양받은 이병주에서 분리된 국화흰녹 병균 균사체 ITS의 PCR 증폭 단편은 340bp이었고, 염기 서열은 이미 발표된 rDNA 염기서열(Alaei 2009; Pedley 2009)과 100% 일치하여(결과 미제시) 본 실험에서 사용 된 공시균주가 국화흰녹병균임을 확인하였다. 동일한 프 라이머를 이용하여 우리나라 4개 지역에서 수집한 국화 흰녹병균 4종과 국화에서 발생되는 국화병원균 5종의 게 놈 DNA를 대상으로 rDNA의 ITS 영역을 증폭한 결과, 지역을 달리한 국화흰녹병균 뿐만 아니라 속이 다르면서 국 화에서 발병되는 타 곰팡이병균 5종에 대해서도 동일한 크기의 DNA를 확인하였다(Fig. 3). Pedley(2009)은 동일 프라이머를 이용하여 국화흰녹병원균과 국화검은녹병균 (Puccinia chrysanthemi)을 PCR로 증폭한 결과 국화흰녹 병균에서만 PCR 증폭 DNA를 확인하였기에 두 종의 병 원균을 구분하였다. 하지만 국내에서 분리된 국화역병균 (Phytophthora sp.), 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum), 점 무늬병균(Septoria obesa) 등 5종 국화곰팡이균에서 동일 한 크기의 PCR 증폭 DNA가 확인되었기에 동일한 프 라이머(PhrF-PhrR)를 이용할 경우 국화흰녹병균과 국화에 서 발병되는 국화흰녹병균을 제외한 곰팡이병원균 등을 구분할 수 없음을 알 수 있었다. 따라서 국화흰녹병균 특 이적 유전자의 프라이머 개발을 시도하였다. 국화흰녹병 균 유전체 정보를 활용하여 10여종의 유전자를 대상으로 국화흰녹병균 특이적 프라이머를 선발하기 위해 30여종 이상의 프라이머 조합으로 PCR을 실시하여 국화흰녹병 균만을 증폭하는 유전자 1종을 선발하였다(Fig. 4). 선발 된 유전자는 기능이 알려지지 않은 Puccinia graminis f. sp. Tritici CRL 균주의 유전자와 DNA 염기서열 수준에 서 67.7%의 상동성을 가진 유전자이었다. 이 유전자를 대 상으로 PhRTF-PhRTR 프라이머(Fig. 4)로 annealing 온 도 65℃에서 PCR를 실시한 결과, 우리나라 국화재배지 4개 지역에서 수집한 국화흰녹병균에 대해서는 182bp 크 기의 DNA가 확인되었지만, 농촌진진흥청 KACC로부터 분양받은 국화역병균, 균핵병균, 흑반병균, 시들음병균 등 5종의 국화에서 발병되는 병원균은 182bp의 DNA가 증폭 되지 않음을 확인하였다(Fig. 5). 따라서 프라이머 PhRTFPhRTR 조합을 이용하여 PCR을 실시하면 국화흰녹병의 감염여부를 특이적으로 검정할 수 있다.

이 실험의 궁극적인 목표는 병원균이 식물조직내에 침 입한 후 가시적으로 병반이 나타나기 이전에 식물체의 감 염여부를 검정하는 것이다. 이를 위해 우선 동일한 PCR 조건에서 국화흰녹병균 게놈 DNA의 검출한계 농도를 조 사하였다. 이때 template DNA는 이병주 잎에서 분리하 여 현미경으로 확인된 순수한 담자포자에서 분리한 DNA 를 사용하였다. 게놈 DNA 10ng에서 0.25까지 2배로 희 석하여 annealing 온도 65℃에서 PCR를 실시한 결과 국 화흰녹병균 게놈 DNA 0.25ng까지 검출이 가능하였다(Fig 6A). 이는 Pedley(2009)가 rDNA를 PCR 증폭하여 얻어 진 검출 한계농도 1ng보다 약 4배정도 민감도가 증가된 결과이다. 뿐만 아니라 국화흰녹병균 검정의 정확도와 정 밀도를 향상시키기 위해 Taqman real-time PCR를 수행 하였다(Fig. 6B). PhRTF-PhRTR 프라이머 조합으로 증폭 된 PCR 산물 182bp를 포함한 T-Ph182의 사본수를 측 정하여 표준곡선을 작성하였다. T-Ph182의 사본수와 CP 값 간의 상관관계를 나타내는 표준곡선의 결정계수(R²)는 0.99으로 매우 높은 수준의 신뢰성을 나타내고 있다(Fig. 6B). 또한 국화흰녹병균 게놈 DNA 량과 CP 값간 상관 관계를 나타내는 그래프에서도 R² > 0.99으로 역시 매 우 높은 수준의 신뢰성을 보이고 있다. 따라서 PhRTFPhRTR 프라이머 조합을 이용한 Taqman real-time PCR 방법으로 국화흰녹병균 게놈 DNA를 6pg 수준까지 검출 할 수 있음을 확인하였다.

향후 이러한 방법을 이용하여 병원균 접종후 가시적 병 징이 나타나기 이전에 국화흰녹병균을 검출할 수 있는 지 를 확인할 예정이다.

초 록

우리나라의 절화국화는 국내 화훼작물 중 큰 비중을 차 지하고 있다. 수출 또한 2011년에는 2001년대비 약 1.9배 증가하였지만 생산단가 상승과 주변 경쟁국들과의 가격 경쟁력으로 수출농가가 어려움을 겪고 있다. 이를 극복하기 위해서는 소비자의 기회에 맞는 품종을 개발하 고 또한 고품질 국화를 생산하는 것이 필요하다. 국화 품 질을 저하시키는 요인 중 하나는 병해충 감염이며, 국화 흰녹병이 가장 심각한 피해를 주고 있다. 국화흰녹병 병 발생을 근절할 수 있는 근본적인 해결책은 저항성 품종 개발이지만 이는 많은 시간이 필요하기에 단기적 방법으 로 가시적으로 병징이 나타나기 이전에 국화흰녹병 감염 여부를 검정할 수 있는 기술을 개발한다면 병 발생 피 해를 최소화할 수 있을 것이다. 국화흰녹병 검정 기술 개 발을 위해 실험실 조건에서 이병주의 연중 생산이 필수 적이기에 이병주를 생산하는 시스템을 우선적으로 확립 하였다. 그리고 자체 생산한 이병주에서 증식된 병원균 의 담자포자의 형태적 특성 및 rDNA의 DNA 염기서열 분석 결과로 국화흰녹병균임을 입증하였다. 또한 국화흰 녹병균 유전체 정보를 이용하여 국화흰녹병균만을 검출 할 수 있는 유전자를 선발하였고 이 유전자를 대상으로 국화흰녹병균 게놈 DNA 0.25ng까지 검출할 수 있는 프 라이머 쌍을 개발하였다. 동일한 프라이머를 이용하여 Real-time PCR를 실시하면 게놈 DNA 6pg까지 검출이 가능하였다.향후 이러한 방법을 이용하여 병원균 접종후 육안으로 병징이 확인되기 이전에 국화흰녹병균의 검출 을 확인할 예정이다.

추가 주요어:

검출한계, 국화흰녹병균, 병원균 접종, 민감도, 특이성