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ISSN : 1225-5009(Print)
ISSN : 2287-772X(Online)
Flower Research Journal Vol.26 No.2 pp.55-60
DOI : https://doi.org/10.11623/frj.2018.26.2.03

Effects of H2O2 and Salicylic Acid Treatment on Monoterpene Content of Eucalyptus pulverulenta

Hyun-Jin Baik*, Bu-Young Yi
Department of Environmental Horticulture, University of Seoul, Seoul 02504, Korea
Corresponding author: Hyun-Jin Baik Tel: +82-2-6490-2687 E-mail: jina4506@naver.com
12/06/2018 19/06/2017 27/06/2018

Abstract


This study was conducted to investigate the effect of H2O2 and salicylic acid (SA) treatment on α-pinene and 1,8-cineole contents in Eucalyptus pulverulenta. E. pulverulenta shoots were soaked in various concentrations of chemical solutions (0.3%, 0.5%, or 1% H2O2 or 0.1 mM or 1 mM SA) or i ts leaves were sprayed with a 0.1mM SA or 1% H2O2 solution. These were then analyzed for their α-pinene and 1 ,8-cineole contents at v arious p eriods after treatment (0, 0.5, 1 , 2, and 4 h). After 2 h of soaking, the α-pinene content in the 0.1 mM SA solution increased from 1.62 to 5.48 mg·L-1 (238.27%, p = 0.012), whereas the 1,8-cineole content in the 1 mM SA solution increased from 44.44 to 78.96 mg·L-1 (77.66%, p = 0.026) after 4 h of soaking. In response to spraying 0.1 mM SA on leaves, after 30 min, the α-pinene content increased from 1.62 to 3.91 mg·L-1 (141.36%, p = 0.007), whereas the 1,8-cineole content increased from 44.44 to 87.91 mg·L-1 (97.82%, p = 0.001), which means both increases were significant. Although both H2O2 and SA solutions had a significant effect to increase α-pinene and 1,8-cineole contents, SA was more effective than H2O2. To increase the content of monoterpenes, we recommend that Eucalyptus shoots be soaked in 0.1 mM SA solution for 2 h or sprayed with 0.1 mM SA solution for 30 min prior to horticultural therapy.



유칼립투스(Eucalyptus pulverulenta)의 monoterpene 함량에 H2O2와 Salicylic Acid 처리가 미치는 영향

백 현진*, 이 부영
서울시립대학교 환경원예학과

초록


    서 언

    스트레스나 불규칙한 생활습관이 각종 질병과 성인병에 영향 을 미치는 원인의 하나로 꾸준히 지적되면서 식물과 식물의 향 이 가지고 있는 스트레스 완화효과와 정서안정, 이완효과 등에 대한 관심이 높아지고 있다. 식물의 향은 분자량이 작아 휘발성 이 강한 monoterpene계 화합물이 대부분이며, monoterpene은 식물의 이차대사산물로 항균, 항산화, 항암, 혈압강하, 혈관 이 완 등 다양한 약리학적 특성을 갖고 있다(Park et al. 2010; Santos et al. 2011). 식물에서 발생되는 향기화합물들은 호흡 시 비강을 통해 후각상피에 도착하게 되며, 이후 공진에 의해 후각수용체 신경세포에 전달되어 향으로 감지된다(Pichersky 2004). 이와 같은 경로로 대뇌 변연계로 전달된 방향화합물들은 신경세포를 자극하게 되는데, 이때 α-pinene, 1,8-cineole, limonene 등의 특정 방향화합물은 부교감신경을 활성화시키고, 교감신경 활성을 억제시켜 혈압, 맥박, 심박수 감소 등 자율신경 계에 영향을 준다(Gomes et al. 2010; Santos et al. 2011). 또한 스트레스 호르몬으로 알려진 cortisol 농도를 떨어뜨리고(Toda and Morimoto 2008; Song 2013), 교감신경계에 의해 방출되는 주된 신경전달물질인 노르아드레날린 수치를 감소시켜(Li 2010) 스트레스를 완화시킨다. 이와 같은 식물 방향화합물의 이완, 진정효과(Jo et al. 2013; Menezes et al. 2010; Park et al. 2010)와 우울감 감소 등과의 연관성은 여러 연구를 통해 보고된 바 있으며(Jin et al. 2014; Souto-Maior et al. 2011), 원예치료나 원예활동에서의 이용이 기대된다. 특히 원예치료에 사용된 식물재료의 체내에서 이들 기능성 방향화합물이 증가된 다면 원예치료활동 시 치료효과의 증대에 도움이 될 것이다. 식물은 스트레스를 받으면 다양한 방어기작이 나타나며, 이는 식물대사의 변화로 연결되어 2차대사산물인 monoterpene의 생합성에도 관여한다(Vickers et al. 2009). 생리활성물질 처리 나 스트레스로 유발된 식물의 방어기작을 이용하기 위한 연구 는 다수 있으며(Huang et al. 2009; Selmar and Kleinwachter 2013), 염스트레스와 관련이 있는 염화나트륨(NaCl)과 신호전 달물질인 살리실산(Salicylic Acid, SA), 살리실산의 합성을 촉진 시키는데 관여(Kang et al. 2008)하는 것으로 알려져 있는 과산 화수소(Hydrogen Peroxide, H2O2) 등이 있다. H2O2와 SA의 처 리는 식물체내에서 활성산소종에 의한 산화스트레스(Lamb and Dixon 1997; Orozco-Cárdenas et al. 2001)와 기공폐쇄(Klessing and Malamy 1994) 등을 유발하는데, 식물호르몬 SA는 스트레 스 조절 호르몬으로 알려진 jasmonic acid와 에틸렌 생합성 조 절을 통해 식물 스트레스 반응 메커니즘 및 식물 내 플라보노이 드와 같은 이차대사물질의 함량을 조절(Klessing and Malamy 1994)하는 것으로도 알려져 있으며, 활성산소종으로 항산화효 소 발현에 관여하는 H2O2는 산화스트레스와 관련(Lamb and Dixon 1997; Orozco-Cárdenas et al. 2001)한 이차대사산물의 증가에 영향이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 스트레 스 완화와 진정효과 등의 치료효과가 뛰어나다고 보고된 α -pinene과 1,8-cineole을 중심으로, 살리실산(SA)과 과산화수소 (H2O2) 등의 처리가 식물체에서 이들의 함량에 미치는 영향을 밝혀 원예치료 활동에 직접적으로 적용하기 위해 최대증가 시 간과 처리 농도, 방법 등에 대한 연구를 시행하였다.

    재료 및 방법

    식물재료 및 처리내용

    식물재료는 화훼작업과 원예치료활동 시 잎 소재로 주로 이용 되며, 기능성방향화합물의 함량이 높은 유칼립투스(Eucalyptus pulverulenta)를 사용하여 침지 또는 살포처리 후 방향화합물을 추출하여 분석하였다. 유칼립투스 가지는 길이 17cm로 균일하 게 잘라 사용하였으며, 1가지 당 잎의 개수는 16개로 제한하였 다. 모든 실험과정은 서울시립대학교 환경원예학과 실험실 (25℃ ± 2)에서 진행되었다.

    침지처리

    과산화수소(H2O2, Junsei chemical Co., Ltd., Japan)를 증 류수에 희석하여 0.3, 0.5, 그리고 1%로 조정한 수용액과 살 리실산(salicylic acid, Sigma-Aldrich Inc., USA)을 0.1mM과 1mM로 녹인 수용액 300mL를 500mL 비이커에 농도별로 3개 씩 담은 뒤(N = 3) 유칼립투스 가지를 꽂았다(농도별로 H2O2 3처리, SA 2처리 총 5처리, 3반복). 침지처리 전(0h)과 처리 후 30분(0.5h), 1시간(1h), 2시간(2h), 4시간(4h) 등 총 5회 각 비이커별로 잎을 채취하여 방향화합물분석에 이용하였다.

    살포처리

    유칼립투스의 가지를 300mL의 물을 채운 500mL 3개씩에 꽂은 뒤, 1% H2O2 수용액과 0.1mM SA 수용액(3mL)을 분무 기를 사용하여, 1시간마다 잎 채취 직후 총4회 살포하였다. 최 초 분무 직전(0h), 분무 30분 (0.5h), 1시간(1h), 2시간(2h), 4시간(4h) 후 총 5회 살포직전에 잎을 채취하여 방향화합물분 석에 이용하였다.

    추출 및 분석 방법

    방향화합물의 추출

    각 처리별 향기성분함량의 변화를 알아보고자 Owens et al.(1998)의 방법에 따라 채취된 식물 시료들을 잘게(3mm ± 1.5mm) 잘라 0.3g씩 50mL Vial에 옮기고, 30mL Hexane(Hexane ≥ 97.0%, Sigma-Aldrich Inc., USA) 용액에 침지하여 추출하였다. 이때 침지온도는 25℃, 침지시간은 48시간(Kazlauskas et al. 2011) 으로 맞추었다.

    방향화합물 분석

    향기성분분석은 수소염이온화검출기(FID)가 설치된 Gas Chromatography(GC Plus 2010, Shimadzu Corp., Japan)에 SH-Rtx-1 Column(60m × 0.25mm × 0.25μm)을 장착하여 사용 하였다. 분리된 향기성분의 동정을 위한 표준물질로는 analytical standard(sigma-aldrich) 등급의 (+)-⍺-pinene, 1,8-cineole을 사용하였다. 초기 오븐 온도는 60℃로 3분간 유지한 후에 5℃ /min의 속도로 150℃까지 상승시켜 6분간 유지하였다. monoterpene은 비교적 빨리 분리되므로 이후 30℃/min으로 200℃로 올려 5분간 유지하여 분석시간을 단축하였다. Carrier gas는 helium(1mL/min)을 사용하였다.

    통계검정방법

    H2O2와 SA 처리에 따른 시간별 종속변인 α-pinene과 1,8-cineole 의 변화를 알아보기 위해 처리(무처리, H2O2, SA 처리)와 측정시간 (30분후, 1시간후, 2시간후, 4시간후)을 독립변인으로 하는 Repeated ANOVA를 실시하였다. 각 요인별 변화에 따른 차이검증 을 위해 사후분석으로 독립 t-test를 실시하였다. 통계검정방법은 IBM SPSS(version 25, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용해 수행하였으며, 평균과 표준오차 값으로 제시하였다.

    결 과

    H2O2 침지처리에 따른 monoterpene 함량변화

    유칼립투스에 H2O2 수용액 0.3, 0.5, 1%를 각각 처리한 후 시간별로 monoterpene 함량변화를 분석한 결과(Table 1), α-pinene과 1,8-cineole 모두 처리시간별 유의한 차이를 보였으 며(p = 0.025, p = 0.020), 처리시간과 처리농도 간에도 유의한 상호작용 효과를 나타냈다(p = 0.038, p = 0.023). 사후분석으로 실시한 독립 t-test결과, α-pinene의 함량(mg・L-1)은 0.3% H2O2 처리 시 2.62 ± 0.19에서 3.42 ± 0.18로 2시간 뒤 유의하게 증가하였으며(p = 0.037), 0.5% H2O2 처리 시 역시 2시간 뒤 2.62 ± 0.19에서 3.76 ± 0 .27로 유의하 게 증가하였다(p = 0.025). 1% H2O2 처리 시에도 30분과 4시간 뒤 각각 2.90 ± 0.35과 2.93 ± 0.15으로 증가하였으나 유의성이 인정되지는 않 았다(p = 0.529, p = 0.270). 1,8-cineole 함량(mg・L-1)은 0.3% H2O2 처리 4시간 뒤와 0.5% H2O2 처리 2시간 뒤 38.22 ± 1.98에 서 45.24 ± 6.24과 44.17 ± 1.66로 증가하였으나 유의성이 인정 되지는 않았다. 1% H2O2 처리 시 1,8-cineole은 38.22 ± 1.98에 서 49.72 ± 2.58로 유의하게(p = 0.024) 증가하였다.

    SA 침지처리에 따른 monoterpene 함량변화

    유칼립투스에 SA 수용액 0.1mM과 1mM을 각각 처리한 후 시간별로 monoterpene 함량변화를 분석한 결과(Table 2), α-pinene과 1,8-cineole 모두 처리시간별 유의한 차이를 보였 으며(p = 0.004, p = 0.001), 1,8-cineole은 처리농도 간에도 유의한 차이를 보였다(p = 0.027). 또한, 처리시간과 처리농도 간 유의한 상호작용 효과를 나타내어(p = 0.001, p = 0.008), 사후분석으로 실시한 독립 t-test결과 α-pinene 함량(mg・L-1)은 0.1mM SA 처리 2시간 뒤 1.62 ± 0.32에서 5.48 ± 0.82로 유 의하게 증가하였으며(p = 0.012), 1mM SA 처리 1시간 뒤와 4시간 뒤, 1.62 ± 0.32에서 3.49 ± 0.55와 3.53 ± 0.38으로 유의하게 증가하였다(p = 0.042, p = 0.019). 1,8-cineole 함량 (mg・L-1)은 0.1mM SA 처리 2시간 뒤 44.44 ± 3.25에서 69.66 ± 7.15으로 유의하게 증가하였으며(p = 0.033), 1mM SA 처 리 1시간 뒤와 4시간 뒤 44.44 ± 3.25에서 71.94 ± 5.11과 78.96 ± 5.11으로 유의하게 증가하였다(p = 0.010, p = 0.026). 사후분석으로 실시한 독립 t-test결과 α-pinene은 1% H2O2 수 용액 살포처리 30분 뒤 2.45 ± 0.49에서 2.94 ± 0.29으로 증 가하였으나 유의성이 인정되지는 않았다.

    H2O2와 SA 살포처리에 따른 monoterpene 함량변화

    유칼립투스 잎에 H2O2 수용액 1%와 SA 수용액 0.1mM을 살포처리한 후 시간별로 monoterpene 함량변화를 분석한 결 과(Table 3), α-pinene과 1,8-cineole 모두 처리시간별 유의한 함량 증가를 보였다(p = 0.002, p = 0.006). 사후분석으로 실 시한 독립 t-test결과 α-pinene 함량(mg・L-1)은 1% H2O2 수용 액 살포처리 30분 뒤 2.45 ± 0.49에서 2.94 ± 0.2으로 증가하 였으나 유의성이 인정되지는 않았다. 반면에 0.1mM SA 수용 액 살포처리 30분과 1시간 뒤 α-pinene 함량(mg・L-1)은 1.62 ± 0.32에서 3.91 ± 0.32과 3.01 ± 0.15으로 각각 유의하게 증 가하였고(p = 0.007, p = 0.017), 1,8-cineole 함량(mg・L-1) 역 시 1mM SA처리 30분 뒤에 44.44 ± 3.25에서 87.91 ± 4.32으 로 크게 증가하였다(p = 0.001).

    고 찰

    원예치료의 효과에는 원예활동과 함께 향이나 색과 같은 식 물 자체의 기능도 중요한 역할을 한다. 식물의 특정 향은 대 상자의 긍정적 행동변화를 유도하고(Baik and Eom 2015), 스 트레스와 우울감 감소, 진정, 이완에 도움이 되며(Gomes et al. 2010; Jin et al. 2014; Souto-Maior et al. 2011), 심리적 안 정감(Kim 2016; Shin et al. 2010; Sowndhararajan et al. 2015) 과 불안을 해소(Lee et al. 2011; Moreira et al. 2014)하는 등 의 정서적 효과가 크다. H2O2와 SA 처리를 통한 식물의 기능 성방향화합물 증가가능성은 일반인을 대상으로 한 스트레스 완화와 심리안정 효과의 적용에 도움이 될 것이며, 우울증 환 자들을 대상으로 한 원예치료 활동 시 비 약물치료의 하나로 약물과 병행치료의 가능성을 열어 식물의 향을 이용한 원예 치료활동의 적극적 적용과 치료효과 증대에도 도움이 될 것 이다.

    H2O2 처리에서는 0.5%를 2시간 처리했을 때 α-pinene의 함 량(mg・L-1)이 가장 크게 증가하였으며(43.51%, 2.62에서 3.76), 1%의 H2O2를 1시간 처리했을 때 1,8-cineole의 함량(mg・L-1) 이 가장 크게 증가하였다(30.09%, 38.22에서 49.72). SA 처리 에서는 0.1mM을 2시간 처리했을 때α-pinene의 함량(mg・L-1) 이 가장 크게 증가하였으며(238.27%, 1.62에서 5.48), 1mM의 SA를 2시간 처리했을 때 1,8-cineole의 함량(mg・L-1)이 가장 크게 증가하였다(77.66%, 44.44에서 78.96). 또한 1% H2O2와 0.1mM SA 수용액을 각각 잎에 분무한 뒤 30분, 1시간, 2시간, 4시간 동안 유칼립투스의 α-pinene과 1,8-cineole의 함량변화 를 분석한 결과 역시 함량증가에 유의한 영향이 있었으며, 0.1mM SA 엽면살포시 α-pinene(141.36%, 1.62에서 3.91)과 1,8-cineole(97.82%, 44.44에서 87.91) 모두 살포 30분 뒤 크 게 증가하였다. 이와 같은 결과는 SA 처리가 monoterpene 생 합성과 방출에 영향을 준다고 보고한 Xu et al.(2011)의 연구 와 같은 경향이었으며, SA 처리가 monoterpene 함량증가에 영향을 준 것으로 판단한다. 식물체가 기계적 상처나 스트레 스를 받게되면 monoterpene 방출과 monoterpene synthase 의 활동을 증가시켜 스트레스나 상처로 인해 손상된 화합물을 대체하는데(Litvak and Monson 1998), 이는 메틸자스몬산 처 리를 통해 모노테르펜 방출량증가를 확인한 Diane et al.(2003) 의 연구와 스트레스 조건 하에서 이차대사산물의 함량증가를 연구한 Bohner et al.(1995)과 Selmar and Kleinwachter(2013) 의 연구 등을 통해 증명된 바 있다. 또한 스트레스를 받은 식 물이 스트레스로부터 회복될 때 일시적으로 휘발성 방향화합 물의 증가가 일어난다(Vickers et al. 2009)는 보고도 있다.

    Monoterpene과 천연생성물의 축적은 온도, 광질 및 영양공 급과 같은 성장 조건에 크게 의존하며(Gershenzon 1984), 이 러한 조건들은 장기간 지속적인 영향을 통해 영향을 미치는 반면, H2O2와 SA의 처리를 통한 산화스트레스와 기공폐쇄 등 을 통한 일시적인 방향화합물의 증가는 이를 유도하기 위해 2 시간 동안 0.1mM SA 수용액에 줄기를 담가놓거나, 0.1mM SA 수용액을 30분 전 엽면살포하는 것만으로도 스트레스감소 와 진정, 안정효과를 가져오는 monoterpene의 함량증가를 기 대할 수 있다. 이런 점에서 H2O2와 SA의 처리는 monoterpene 방출량을 증가시켜 원예치료 프로그램의 치료효과를 높이고, monoterpene의 종류별 증가 조건이 다르므로 대상자나, 적응 증을 감안하여 원예치료의 운용상황과 처리물질을 체계적으 로 활용하는 데 유용한 기초자료가 될 수 있을 것으로 판단된 다. 이번 실험에서는 침지처리 시 α-pinene과 1,8-cineole의 농 도증가 시간과 침지와 분무 등 처리화합물과 농도별 증가시간 이 달랐으나 이를 구명하기엔 실험의 규모에서 처리의 종류와 수준이 많지 않고, 한 가지 작물, 한 품종만을 사용했다는 제한 점이 있었다. 처리 화합물의 농도와 시간에 따라 monoterpenes 함량의 증가와 감소가 다른 상황은 식물체에서 분리된 가지에 서 monoterpene의 전구물질의 양은 제한된 상태에서 지속적 으로 증가할 수는 없었으리라는 점과, 스트레스로 인한 감소 후 발생 등도 고려할 수 있지만, 이번 실험에서는 원인구명을 할 수 없었다. 이들 제약점이나 미흡한 점을 밝히기 위해서는 원예치료재료로 사용되는 식물의 품종간, 종간 비교와 적정 화합물 및 농도 등 처리방법에 대한 폭넓은 실험이 필요하며, 이를 통해 원예치료의 효율이 더욱 높아지리라 기대한다.

    초 록

    본 연구는 유칼립투스(Eucalyptus pulverulenta) 잎에서 치 료적 효과가 큰 α-pinene과 1,8-cineole 함량증가에 미치는 H2O2와 SA 처리의 영향에 대해 알아보기 위하여 수행하였다. 유칼립투스가지를 H2O2 수용액(0.3, 0.5, 1%)과 SA 수용액(0.1, 1mM)에 침지하거나 잎에 엽면살포(0.1mM SA, 1% H2O2)한 뒤 시간흐름(0, 0.5, 1, 2, 4시간)에 따른 α-pinene과 1,8-cineole 의 함량변화를 분석한 결과, 침지처리에서 유칼립투스 잎의 α-pinene 함량(mg・L-1)은 0.1mM SA에 2시간 침지 후 1.62에 서 5.48로 크게 증가하였으며(238.27%, p=0.012), 1,8-cineole 함량(mg・L-1)은 1mM SA에 4시간 침지 후 44.44에서 78.96으 로 크게 증가하였다(77.66%, p=0.026). 살포처리에서는 0.1mM SA를 엽면살포 30분 후 α-pinene 함량(mg・L-1)은 1.62에서 3.91로(141.36%, p=0.007), 1,8-cineole 함량(mg・L-1)은 44.44에 서 87.91로 증가하였다(97.82%, p=0.001). α-pinene과 1,8-cineole 모두 살포처리 30분 뒤 크게 증가하여, 엽면살포가 짧은 시간 내에 방향화합물을 증가시키는데 침지처리보다 효과적이었으 며, H2O2와 SA 처리는 α-pinene과 1,8-cineole의 함량증가에 유의한 영향이 있었다. 또한, SA의 처리가 H2O2보다 방향화 합물 함량증가에 더 효과적이었으며, 유칼립투스 가지의 경우 원예치료 2시간 전에 0.1mM SA 용액에 담그거나 30분 전에 잎에 살포하면 monoterpene의 유칼립투스 함량이 크게 증가 되었다.

    추가 주요어: 원예치료, 향기화합물, 식물 향, 휘발성 성분

    Figure

    Table

    The changes in monoterpene content of Eucalyptus pulverulenta over time after H2O2 soaking treatment.

    The changes in monoterpene content Eucalyptus pulverulenta over time after SA soaking treatment.

    The changes in monoterpene content of Eucalyptus pulverulenta over time after H2O2 and SA spray treatment.

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