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붓꽃과에 속하는 프리지아(Freesia refrecta)는 남아프리카 원산의 추식구근으로, 다양한 화색과 은은한 향을 지니고 있 다. 특히 저온성 화훼작물로 겨울철에 난방비가 문제가 큰 부 담이 되고 있는 현실에서 절화 및 분화로 많이 이용되고 있다 (Cho et al. 2007). 과거에는 네덜란드에서 육성된 품종의 구 근을 수입해서 재배하는 경우가 많아 총 생산비 중에서 구근 구입비중이 매우 높았다. 그러나 근래에는 우리나라 원예특작 과학원에서 육성된 프리지아 품종들이 국내외 시장에서 호평 을 받음으로써 재배면적이 크게 증가하였다(MAF 2009). 프리 지아를 증식하는 전통적인 방식은 구경(corm)을 수확할 때 새 로 생긴 자구를 이용하여 번식하고 있다. 자구를 자가 채취하 여 지속적으로 재배하게 되면 형질이 퇴화되거나 바이러스 감 염에 의한 수확량 감소와 같은 문제가 발생하게 된다(Ko et al. 2003). 또한 대량의 정식구를 확보하기까지 시간이 많이 필요하고 품질도 균일하지 못하는 문제가 있다. 따라서 이런 문제를 극복하기 위한 방법으로 생장점 배양에 의한 무병묘 생산이 제안되어 왔다. 일반적으로 생장점 배양을 통해 새로 운 묘를 만들게 되면 퇴화되었던 형질이 회복되고 virus free 개체를 얻을 수 있기 때문이다(Kim et al. 1997; Kim et al. 2013; Kim et al. 2014). 무병묘가 만들어지면 가능한 한 짧은 기간에 품질이 균일한 대량의 묘를 생산하여야 한다.
지금까지의 연구결과 조직배양을 통하여 프리지아 구경을 기 내에서 직접 비대시키는 기술이 개발되어 왔다(Kim et al. 2013). 프리지아 구경을 3mm 두께의 절편으로 잘라 고체 배지 에 상하를 거꾸로 치상하면 다수의 신초를 유기할 수 있다(Lim et al. 2015). 이렇게 얻어진 1cm 전후의 신초를 MS 고체 배지에 치상하여 12~15cm 신초로 신장시킨 다음, 고농도 sucrose(20%) 배지에 치상하여 암실에 두게 되면 구경이 비대하여 정식 가능 한 크기의 구경을 얻을 수 있게 된다(Kim et al. 2013). 이 기술은 계절과 상관없이 원하는 품질의 구경을 언제라도 지속적으로 생산할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 이 방법은 어린 신초로부 터 정식할 수 있는 크기의 구를 얻기 위해서는 10개월 이상의 장시간이 소요된다는 단점이 있다. 최근에 이러한 문제를 극복 하기 위한 방법으로 액체배지를 이용한 진탕배양 방법이 제안되 었다(Kang et al. 2016). 액체진탕배양으로 프리지아의 어린 신 초를 배양하게 되면 정식 가능한 크기의 구경을 얻는 데까지 6주면 충분하게 된다. 이 기술을 적용하여 프리지아 구경을 기내 에서 대량생산하기 위해서는 생물반응기(Bioreactor)를 이용한 실험이 선행되어야 한다. 생물반응기를 이용하여 식물체를 배양 하게 되면 고체 배지에서 보다 생육이 훨씬 빠르기 때문에 식물 체 증식이나 유용물질을 생산하는데 매우 효과적인 수단이 될 수 있다(Debnath 2008; Murthy et al. 2008; Wu et al. 2006). 이런 결과는 유색칼라의 신초(Han 2011)와 Astragalus 부정근 (Wu et al. 2011), 다알리아 신초(De klerk and Brugge 2011), Echinacea angustifolia(Jeong et al. 2009)에서도 확인된 바 있다. 이와 같이 액체배지를 이용하여 생물반응기로 식물을 배양하는 것은 생육을 현저하게 촉진시킬 뿐 아니라 생산비를 절감시키고 생산과정을 자동화할 수 있는 장점도 있다(Deberg 1988).
따라서 본 연구에서는 생물반응기를 이용하여 국내 육성 프 리지아 구경의 기내 급속 대량증식 기술을 확립할 목적으로 신초로부터 정식 가능한 크기의 구경으로 비대시키고자 할 때, 적정 배지 농도, 식물량, sucrose 농도 및 공기 공급량과 같은 배양조건을 구명하고자 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
식물재료 및 생물 반응기
국내에서 육성된 프리지아 ‘Shiny Gold’의 구경 절편을 Lim et al.(2015)의 방법대로 고체배지 위에 역위치상하여 어린 신 초를 얻었다. 다시 그 신초를 Kang et al.(2016)의 방법 같이 30g･L-1 sucrose를 첨가한 1/2 MS배지에 어린 신초(< 1cm)를 넣어 4주간 배양하여 얻어진 12cm 이상의 신초를 사용하였 다. 본 실험에 사용된 생물반응기는 balloon type으로 배지 공 급은 immersion방식, 크기는 5L이었다. 특별한 언급이 없는 한, 기본 배지는 1/2MS 액체배지에 sucrose 90g·L-1를 첨가 한 다음 pH를 5.8로 조정하여 121℃에서 15분간 고압증기멸 균기로 소독하여 사용하였다. 배지량은 5L 생물반응기에 1L씩 넣어 사용하였고(식물량 실험에서만 2L 이용), 치상 신초수는 40개씩을 사용하였다. 공기주입량 실험을 제외한 다른 모든 실험의 공기 주입량은 0.1vvm으로 동일하게 설정하였다.
구경 비대를 위한 배양 조건
생물반응기에서의 freesia 구경 비대를 위한 적정 배지 농도 를 알아보기 위해, MS 배지 농도를 1/4, 1/2, 1배 3가지로 하였 다. Sucrose는 9, 12, 15% 3가지 농도로 하였고, 신초수는 40, 80, 120, 160개/2L 4가지 처리를 하였다. 배양 도중 배지교환을 어떻게 하는 것이 더 구경비대에 효과적인지를 알아보기 위해, 대조구로 배지교환을 전혀 하지 않은 경우, 동일한 배지로 배지 의 1/2만 추가해 준 경우, 동일한 배지로 배지 전체를 교체해준 경우 이렇게 3가지 경우로 나누어 실험을 수행하였다. 생물반 응기는 온도 17℃, 습도 60%, 암상태의 배양실에서 배양하였 다. 배양 6주 후에 신초당 구경수, 구경(corm width), 구고 (corm height), 구생체중, 구건물중을 조사하였다.
이렇게 얻어진 데이터는 SAS(Statistical Analysis System, V. 9.1, Cary, NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 ANOVA 검정 과 Duncan’s multiple range test를 이용하여 5% 수준에서 처 리 평균값 간의 유의성을 검정하였다.
결과 및 고찰
MS배지 농도, sucrose농도 및 치상 신초수가 구경 비대에 미치는 영향
MS배지 농도와 sucrose 농도 그리고 치상 신초수를 달리하 여 프리지아 신초를 생물반응기에서 6주간 배양했을 때 구경 비대에 미치는 결과는 Fig. 1, 2과 Table 1에서 보는 바와 같 았다. 신초당 구경수는 모든 처리구에서 1개로 동일하였다. 다른 선행 연구의 경우에는 액아 발생과 개체수 증식이 많은 것으로 보고되었으나, 본 실험에서는 신초당 단 한 개의 구경 만이 비대되는 것이 관찰되었다. 그 원인으로는 식물 생리적 특성에 차이가 있기도 하지만, 다른 선행 연구들과 달리 본 연 구에서는 식물호르몬을 전혀 사용하지 않았기 때문으로 생각 된다. 일반적으로 오옥신이나 사이토카이닌을 사용하게 되면 세포 분열이 더 활발해져서 액아 발생이 더 촉진되는 것으로 보고되어 있다(Ahn et al. 2007: Shaik et al. 2010; Winarto et al. 2013).
구경 비대는 모든 농도의 MS 배지에서 관찰되었으며 그 중에 서도 1/2배 배지에서 생체중과 건물중이 각각 0.56g와 0.24g으 로 가장 높았다. 이어서 1배 배지에서 1/2배 배지 보다는 작지만 유의적인 수준은 아니었다. 구고와 구폭도 생체중과 비슷한 경 향으로 1/2배 배지에서 구고 12.2mm, 구폭은 8.9mm이였으며, 1배 배지에서는 이 보다 조금 낮은 수준이었으나 유의적인 수준 은 아니었다. Dendrobium ‘Zahra FR62’ PLB 도 1/2배 MS 배지 에서 생장과 증식이 빨랐다고 보고되었다(Winarto et al. 2013). Lessertia frutescens L.을 이용하여 몇 가지 배지를 비교하였을 때, MS 1배 배지에서 신초 발생수가 가장 좋았다(Shaik et al. 2010). Sucrose 농도에서는 9% sucrose 농도에서 생체중과 건 물중이 각각 0.67g과 0.29g로 가장 높았으며 그 이상으로 sucrose 농도가 올라갈수록 생체중과 건물중이 감소하는 경향 이 뚜렷하였다. 12%에서는 9%에서의 구경 생체중과 건물중 보 다 1/2 수준으로 감소하였고, 15%에서는 다시 1/2로 감소하였 다. 구고에서는 9%와 12%에서 9.8~10.3mm로 유의적인 차이가 보이지 않았으나, 15%에서는 약 6mm로 현저하게 감소하였다. 구폭은 9%에서 9.15mm로 가장 컸고 그 이상의 sucrose 농도에 서는 구폭도 크게 감소하였다. 백합의 경우 sucrose 농도가 낮 으면 소인경이나 인편엽이 발생되고 농도가 높아질수록 소인경 비대가 촉진된다고 하였다(Takayama and Missawa 1979)으며, Lian et al.(2003)은 생물배양기에서 나리를 배양했을 때, 9% sucrose가 첨가된 배지에서 구비대가 가장 효과적이었다고 하 였다. Wu(2002)는 백합 소인경을 sucrose 농도를 달리하여 배 양했을 때, 0%에서 9%까지는 농도가 높아질수록 소인경 비대도 촉진되었으나 12%에서는 오히려 비대가 감소되었다. 프리지아 의 경우 고체배지를 이용했을 때는 20% sucrose에서 구경비대 가 가장 잘 이루어졌다(Kim et al. 2013). 그러나 액체배지를 이용하여 sucrose 농도를 6%에서 12%까지 4단계로 하여 진탕 배양했을 때는 9% sucrose에서 구경비대가 가장 좋았던 결과 (Kang et al. 2016)를 얻어, 구경이 비대하는데 필요한 sucrose 요구도가 고체배지에서와 액체배지에서는 크게 다르다는 것을 알 수 있다. 본 연구에서도 9%에서 15%까지 3단계로 sucrose 농도를 검토해 본 결과 액체진탕배양에서와 같이 9%에서 구경 비대가 가장 잘되었다. 이 이상의 농도에서는 오히려 구경 비대 가 억제되었다. 이와 같이 구근 식물의 경우 배지에 고농도의 sucrose를 넣어 기내에서 구경을 비대시킬 수가 있는데, 튤립 (Rice et al. 1983; Taeb and Alderson 1990)과 히야신스(Bach 1992)에서도 고농도의 sucrose 배지에서 기내 구경 비대를 얻는 데 성공하였다. 이는 배지내의 sucrose가 흡수되어 구경내의 저장양분으로 이용되기 때문이다.
적정 치상 신초수를 구명하기 위한 실험에서 배지 2L 당 120개의 신초를 배양했을 때, 생체중과 건물중이 각각 0.52g 과 0.15g으로 가장 높았다. 그 다음은 160개를 치상하였을 때 생체중과 건물중은 각각 0.43g과 0.13g로 조금 낮아졌으며, 신초수가 80개에서 40개로 감소할수록 생체중과 건물중도 감 소하였다. 구고와 구폭도 생체중의 변화와 매우 비슷한 변화 를 보여주었다. 신초수 120개를 치상했을 때, 구고는 약 14mm, 구폭은 9.6mm로 가장 컸으며 다음이 160개를 이용했 을 때, 그리고 80개 40개 순으로 점차 구고와 구폭의 크기는 감소하였다. 생물반응기를 이용하여 식물체를 배양할 경우, 치상 식물체량은 공기주입량과 더불어 식물 생장에 지대한 영 향을 미치게 된다(Ahmed et al. 2008; Lee et al. 2010). Winarto et al.(2013)도 식물체를 생물반응기에서 배양할 때, 치상 식물체 밀도가 식물체의 생육과 증식에 지대한 영향을 미치며, Dendrobium의 PLB(protocorm like bodies)의 경우 배지 500mL에 대해 10g의 PLB를 넣었을 때 최고의 결과를 얻 을 수 있다고 하였다. Phalaenosis(Young et al. 2000)와 Oncidium ‘Sugar Sweet’(Yang et al. 2010)의 경우는 배지 1L 에 PLB 20g을 넣어주었을 때 PLB의 생육이 가장 좋았다. 본 연구의 결과 배지 2L에 신초 120개를 넣었을 때 가장 좋을 결 과를 얻었지만, 앞으로 배지량을 3L까지 더 늘리고 배양 신초 수도 더 증가시켜 실험을 할 필요가 있을 것으로 보인다.
배지교체 방법이 기내 구경비대에 미치는 영향
생물반응기를 이용하여 같은 배지에서 식물을 1개월 이상 배양하게 되면 식물에 의해 흡수되는 량과 자연감소량에 의해 배지량이 크게 감소하게 된다. 그러므로 식물의 생장을 지속 시키기 위해서는 배양 중간에 배지를 보충해주어야 한다. 본 실험에서는 배양 3주만에 배지 교체 방법을 달리하여 실험을 수행하였다. 그 결과 전체를 교체해준 처리에서 생체중과 건 물중이 각각 0.54g과 0.21g으로 가장 높았다(Fig 3, 4, Table 2). 그 다음은 1/2만 보충해준 처리로 각각 0.44g과 0.17g으로 나타났다. 배지를 교체해주지 않았을 때는 구경의 생체중과 건물중이 현저하게 감소하였다. 이러한 경향은 구고와 구폭에 서도 뚜렷하게 나타났다. 배지 전체를 갈아준 경우에 구고와 구폭 각각 13.6mm와 9.69mm로 가장 높았으며, 다음은 1/2 교체구에서는 전체를 교체해준 처리구보다 약간 떨어지는 정 도였다. 그러나 대조구에서는 구고와 구폭에서도 뚜렷하게 감 소하였다. Dendrobium을 생물반응기에서 배양할 때, 배지를 15일 간격으로 교체해 주었을 때, callus로부터 PLB가 가장 잘 형성되고 증식도 좋았으며(Winarto et al. 2013), 백합 인경을 생물반응기에서 생장시키기 위해서는 9% sucrose를 이용하여 2번 교체해주는 것이 가장 좋은 것으로 보고되었다(Lian et al. 2003).
일부 식물에서는 식물조직을 액체배지에 계속 담궈서 배양 을 하게 되면 과수화(hyperhydricity) 현상이 발생하여 식물 잎이 너무 두터워지거나 잎이 뒤틀리는 증상이 나타나기도 한 다(Shaik et al. 2010). 그 이유로 생물반응기 내부는 습도가 높고 가스교환이 부족하며 에틸렌이 축적될 수 있기 때문인 것으로 알려져 있다(Dewire et al. 2006). 그러나 생물반응기 로 6주만에 얻어진 프리지아 구경은 손으로 힘을 주어 눌러보 아도 아무런 변화가 없을 정도로 단단하였으며, 생산된 구경 을 인공용토에 식재하여 본 결과, 발아하는 것을 확인할 수 있 었다(데이터 생략). 생물반응기를 통해 생산된 백합 인경에서 도 과수화 현상은 보이지 않았다(Lian et al. 2003). 고체 배지 에서 생산한 프리지아 구경은 농가에서 바로 정식해도 되나 일정 고온에서 안전하게 휴면을 타파시킨 후 사용하고 있는 것으로 알려져 있다. 조직배양 기술을 통해 생산된 구근 역시 휴면 여부가 매우 중요한 문제가 되며, 배양 온도가 가장 중요 한 요인으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 백합의 경우 20℃ 이상에서 배양을 하게 되면 휴면에 들어가나 15℃ 이하에서 배양을 해서 얻은 인경은 휴면이 얕거나 거의 없다(Stimart and Ascher 1981). 본 연구는 배양 온도를 17℃로 했기 때문 에 휴면이 거의 없을 것으로 보이나, 일부 구경에서는 발아가 늦어지는 경우도 있어, 금후 생물반응기에서 얻어진 프리지아 구경의 휴면 여부와 휴면타파 기술에 관한 실험이 필요하다고 생각된다.
결론적으로 프리지아 신초를 1/2MS 배지가 들어 있는 생물 반응기에 넣어 암상태에서 배양하여 6주만에 정식 가능한 구 경을 얻을 수 있었다. 이때 최적 배양 조건으로는 MS배지는 1/2배, sucrose 농도는 9%, 치상 신초수는 120개를 사용하고 배지 교체는 배양 3주째에 배지 전체를 교체해 주었을 때 가 장 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 이런 결과는 고체 배지에서 8-10개월 걸리던 기내 구경 생산 기간을 6주로 획기적으로 단 축시킬 수 있고 하나의 생물반응기에서 대량의 구경을 일시에 생산할 수 있어 시간과 노동력을 크게 절감시킴으로써 생산비 를 대폭적으로 줄이는 효과가 있을 것으로 기대된다.
초 록
프리지아는 저온성 구근식물로 자구로 번식하는 대표적인 영양번식 작물이기 때문에 오랫동안 재배하게 되면 형질이 퇴 화하거나 바이러스에 감염되는 문제가 발생한다. Virus free묘 (무병구)를 생산하기 위해서는 생장점 배양과 기내 급속대량 증식체계가 확립되어야 한다. 본 연구에서는 생물반응기를 이 용하여 프리지아 구경을 기내에서 급속 대량증식시키기 위한 기술 개발을 목표로 하였다. 조직배양을 통해 얻어진 프리지 아 ‘Shiny Gold’ 신초(12~15cm)를 식물재료로 하여 생물반응 기(5L balloon type bubble bioreactor) 에서 구경 비대를 위 한 적정 배지농도, sucrose농도, 치상 식물체량, 배지 교체 방 식에 대해 실험을 수행하였다. 배지 농도는 MS 배지를 1/4, 1/2, 1배로 하였고, sucrose 농도는 9, 12, 15%로, 치상 식물체 는 40, 80, 120, 160개/2L medium으로 하였다. 또한 배지교체 는 배양 3주째에 배지의 1/2만 보충하거나 전체를 교체한 경 우, 그리고 실험 종료시까지 배지를 교체하지 않은 경우로 했 다. 그 결과, 배지농도는 1/2 MS 배지, sucrose는 9%, 치상 신 초수는 120개로 했을 때, 그리고 배지 교체는 3주째에 배지 전체를 교환해 주었을 때, 구비대가 가장 좋은 것으로 나타났 다. 이런 배양 조건에서 배양개시 6주만에 생체중과 건물중이 각각 0.5g과 0.15g, 구고와 구경은 각각 13mm와 0.9mm 이상 의 정식 가능한 크기의 구경을 생산할 수 있었다. 이러한 결 과들은 프리지아 구경을 기내에서 생산하고자 할 때, 생산 비 용과 기간을 획기적으로 단축시킬 수 있을 것으로 기대한다.
추가 주요어: 벌룬타입 생물반응기, 구경비대, 배양조건, 배지 농도, 자당 농도
