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붓꽃과에 속하는 프리지아(Freesia refrecta)는 남아프리카 원산의 추식구근으로, 다양한 화색과 은은한 향을 지니고 있으며 저온성 화훼작물로 절화 및 분화로 많이 이용되고 있다(Cho et al. 2015). 과거에는 네덜란드에서 육성된 ‘Yvonne’ 품종이 많이 재배되고 있었으며 구근 수입으로 인해 총 생산비 중에서 구근 구입비중이 매우 높았다(Cho et al. 2011). 그러나 근래에는 국내에서 육성된 프리지아 품종들이 국내외 시장에서 호평을 받음으로 인해 재배면적이 크게 증가하였다(Cho et al. 2011). 국내 육성 품종들이 보급되고 8, 9년이 지나는 동안 농가에서 바이러스가 발생하는 등 수량과 품질이 감소되는 문제가 발생되고 있다(Ko et al. 2003). 그렇기 때문에 무병주 프리지아를 만들고 농가에 보급하는 일은 무엇보다도 시급한 과제가 되고 있다. 지금까지 많은 원예작물에서 생장점 배양을 통한 바이러스 무병묘 생산에 대한 연구가 이루어져 왔다(Kim et al. 2003; Kim et al. 2006; Kim et al. 2014). 그 동안 프리지아 조직배양에 관한 연구로는 무기염류와 생장조절물질(Kim et al. 1997), 적정 호르몬 종류와 농도(Ko et al. 2003), 절편체의 치상방법(Lim et al. 2015) 등에 관한 보고가 있으나 모두 고체배지를 이용한 기술이었다.

Kim et al.(2013) 은 프리지아 구경을 기내에서 직접 비대시키는 기술을 개발하였는데, 이를 위해서는 고농도의 sucrose (20%)가 첨가된 고체 배지에 치상하고 17℃ 암상태에서 배양 해야 한다. 그러나 이 방법은 정식할 수 있는 크기의 구를 얻기 위해서는 8 개월 이상이나 배양실에서 관리를 해야 하는 문제가 있다. 동시에 고체배지를 만들기 위해서는 일반적으로 배지에 agar를 약 8g·L^-1를 넣어주고 있는데, agar는 식물의 생장을 억제시키는 작용을 하거나 식물 이식체로부터 유해한 물질이 분비되었을 때 다른 부분으로의 확산을 억제하기 때문에 생장을 방해하는 것으로 알려져 있다(Powell 1987). 그렇기 때문에 그 동안 agar를 사용하지 않고 액체배지를 사용하는 방법이 연구되어 왔다. 액체배지를 이용하는 것이 가능하 게 되면 생산비를 절감시킬 뿐 아니라 생산과정을 자동화할 수 있는 장점도 있다(Deberg 1988). 또한 액체배지 사용은 계대배양 시 배양 용기를 바꾸지 않고 그대로 사용할 수 있는 점과 사용 후 용기 세척이 간편하다는 점 등도 장점이 될 수 있다(Etienne and Berthouly 2002).

조직배양시 액체배지를 이용하면 이식체의 생육이 고체 배지에 비해 훨씬 촉진된다는 연구결과들이 계속 보고되고 있다. Han(2011)은 유색칼라의 신초생육에 대한 고체 배지와 액체배지를 비교한 결과 비록 신초 발생수는 고체배지보다 적었지만 신초의 생육은 액체배지에서 월등히 뛰어났다고 보고 하였다. 이와 같이 액체배지에서 신초발생이 촉진되는 현상은 아나나스(Ananas comosus)(Firoozabady and Gutterson 2003), Camelia sinensis(Sandal et al. 2001), Drosera allice와 Drosera binate(Kawiak et al. 2003) 등에서도 보고되었다. 또한 Eum et al.(2010)은 나리 인편을 액체진탕배양했을 때, 고체배지에서 보다 구 비대가 크게 촉진되었다고 하였다.

이와 같이 액체진탕배양을 이용하면 고체배지에서보다 절편체의 생육과 자구비대가 크게 촉진되는 효과가 있는 것을 알 수 있다. 따라서 본 연구에서는 액체진탕배양을 이용하여 국내 육성 프리지아 ‘Shiny Gold’의 신초 생육 및 구경 비대에 효율적인 환경조건을 구명하여 기내 급속 대량증식 기술을 확립하고자 실험을 수행하였다.

재료 및 방법

식물재료 및 소독

국내에서 육성된 프리지아 ‘Shiny Gold’의 구경 절편을 기내에서 부정아와 신초를 발생시켜 실험에 이용하였다. 프리지아 구경을 소독하기 위해 흐르는 수돗물에 깨끗이 세척하고 가장 외곽에 있는 구피를 제거한 후 70% 에탄올에서 10분간 교반하여 일차 소독을 하였다. 다시 안쪽에 있는 4 ~ 5장의 구피를 모두 제거하고 70% 에탄올에 5분간 처리한 후 Tween 20을 첨가한 2% NaOCl 에서 10분간 소독하여 2차 소독을 하였다. 2차 소독 후 클린벤치로 이동하여 다시 70% 에탄올에서 30초간 처리하고 1% NaOCl 에서 3분간 소독함으로써 소독과정을 끝냈다. 매 처리마다 멸균수로 3회 이상 구경을 세척하였다. 소독이 끝난 구경은 Lim et al.(2015)의 방법대로 filter paper에서 건조시킨 후, 횡으로 3mm 두께로 절단하여 MS 고체 배지에 상하를 바꾸어 치상하였다. 절편체가 치상된 배양 병은 23℃, 암조건에서 8주간 배양 후 광으로 옮겨주었다. 암상태에서는 부정아와 신초가 거의 투명하거나 백색이었으나 광으로 옮긴 후 점차 녹색을 띠기 시작하였다. 신초생육에 대한 실험은 이렇게 얻어진 부정아를 이용하였다.

신초 생육을 위한 MS배지 농도와 Sucrose 농도

배지는 MS 배지를 기본배지로 이용하였으며 sucrose 30g·L^-1를 첨가한 후, pH를 5.8로 조정하고 121℃에서 15분간 고압 증기멸균기로 소독을 하였다. 신초생육을 위한 적정 MS 배 지 농도를 구명하기 위해 MS 배지 농도를 1/4, 1/2, 1배 3가지로 하였다. 적정 Sucrose 농도를 찾기 위해서는 sucrose를 3, 6, 9% 3가지로 하였으며 이때 배지는 1/2배 MS를 사용하 였다. 배지는 100mL 삼각플라스크에 50mL씩 분주하여 실험에 사용하였다. 고체배지에서 생산된 프리지아 부정아 또는 신초 생육이 막 시작된 조직들을 플라스크당 5개씩 치상하였 으며 각 처리당 5반복으로 실험을 수행하였다. 치상 후 온도 23 ± 1℃, 광도 60㎛ol·m^-2·s^-1(16h/8h), 150rpm의 액체진탕배양기에서 4주간 배양 후 신초수, 신초의 초장, 뿌리수, 최대근장, 생체중과 건물중, 그리고 배지의 pH, EC 등을 조사하였다.

구경 비대를 위한 sucrose, 온도, 광 조건

액체배지에서 프리지아의 구경 비대를 위한 적정조건을 찾기 위한 실험을 수행하였다. 대조구로는 Kim at al (2013)이 한 방법대로 기내에서 자란 길이 8 ~ 10cm 정도의 신초를 한 천이 8g·L^-1 첨가된 1/2 MS 배지에 치상하여 17℃, 암상태에서 배양하였다. 이때 sucrose는 20%, 활성탄은 0.1%가 되도록 첨가하였다. 액체 진탕배양에서의 구경 비대를 위한 적정 sucrose 농도를 알아보기 위해 1/2MS 배지에 sucrose를 3, 6, 9, 12% 4가지 농도로 배지를 준비하였다. pH를 5.8로 조절하고 액체 배지를 300mL 삼각 플라스크에 60mL씩 분주하였다. 플라스크당 5개의 신초(길이 8 ~ 10cm)를 치상하고 각 처리당 5반복으로 실험을 수행하였다. 치상 후, 플라스크를 진탕배양기(SH-800, Semyoung Tech, Incheon, Korea)에 고정시키고 150rpm 속도로 진탕을 해 주었다. 온도 17℃, 명조건에서 6주간 배양하고 자구수, 구경, 구고, 구생체중, 구건물중을 조사하였고 배지의 pH와 EC를 분석하였다. 암조건이 구경 비대에 미치는 영향을 알아보기 위해 상기 명조건과 거의 유사한 실험을 다시 한번 수행하였다. 단, 이때는 sucrose 농도를 6, 9, 12, 15%로 약간 상향 조정하여 실험을 수행하였다. 다른 배양 조건과 생육조사 등은 명조건 실험과 동일하게 하였다.

배양 6주 후 얻어진 데이터는 SAS(Statistical Analysis System, V. 9.1, Cary, NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 ANOVA 검정과 Duncan’s multiple range test를 이용하여 실험군 평균값 간의 유의수준 5%에서 유의성을 검정하였다.

결과 및 고찰

액체 진탕배양시 기내 신초생육을 위한 적정 MS배지 농도와 sucrose농도

조직배양을 통해 얻은 프리지아 ‘Shiny Gold’ 부정아를 액체 진탕배지에서 생육시킬 때, MS배지농도에 따라 신초 생육이 크게 다르게 나타났다. 신초의 생체중은 1/2배 배지에서 1.04g로 가장 높았으며, 1/4배와 1배 농도에서는 각각 0.70g, 0.67g로 나타났다(Fig. 1A, B). 신초의 건물중도 생체중과 매우 비슷한 경향을 보여 주었다. 1/2배 배지에서 0.08g으로 가 장 높았고, 1/4배와 1배 농도에서는 각각 0.06g, 0.05g로 비슷한 것으로 나타났다. 신초수는 모든 처리에서 유의적인 차이가 없이 1개의 신초만 신장하는 것으로 나타났다(Table 1). 그 러나 초장은 1/2 배지에서 12.35cm로 가장 높았으며 1배와 1/4배 배지에서 각각 11.21cm, 8.40cm로 유의적인 차이가 인정되었다. 뿌리수도 1/2배 배지에서 1.53개로 1/4배와 1배 배 지에서보다 높은 것으로 나타났다. 최대근장도 뿌리수와 비슷한 경향을 보였는데 1/2배 배지에서 5.36cm로 가장 길었으며, 1/4배와 1배 MS 배지에서 3.2cm, 1.10cm로 1/2배 농도에서보다 많이 낮았다.

Chen et al.(2010)은 오미자(Schisandra chinensis)의 조직 배양시 저농도의 무기염 배지에서 체세포 발생과 식물체 재분화가 잘 이루어졌다고 하였다. Han(2011)은 유색칼라의 신초 생육에 대한 고체 배지와 액체배지를 비교한 결과 비록 신초 발생수는 고체배지보다 적었지만 신초의 생육은 액체배지에서 월등히 뛰어났던 것으로 보고하였다. Piatczak et al. (2005)도 Centaurium erythraea을 액체배지에서 배양하였을 때 고체배지에서보다 3배 이상의 신초를 얻을 수 있었다고 하였다. 다알리아의 신초는 고체배지에서보다 액체배지에서 4배 나 생육이 빨랐다(De klerk and Brugge 2011). 이와 같이 액체배지에서 신초발생 및 생육이 촉진되는 현상은 아나나스(Ananas comosus)(Firoozabady and Gutterson 2003), 장미(Pati et al. 2006), Camelia sinensis(Sandal et al. 2001), Drosera allice와 Drosera binate (Kawiak et al. 2003) 등에서도 보고되었다. 결론적으로 본 실험을 통해 액체배지는 고체배지보다 식물의 생육을 촉진시키는 것으로 확인할 수 있었으며, 프리지아 부정아로부터 신초를 생장시키기 위해서는 1/2배 MS 액체배지가 가장 좋은 것으로 판단되었다.

액체진탕배양 시 프리지아 신초생육에 미치는 sucrose농도의 영향은 Fig. 1과 Table 1과 같았다. 신초의 생체중은 sucrose 3%에서 0.62g로 가장 높았으며, sucrose 6%와 9%에서 0.29g, 0.26g로 나타났다(Fig. 1C, D). 건물중도 생체중과 비슷한 경향으로 sucrose 3%에서 0.08g로 가장 높았으며, sucrose 6%와 9%에서 0.05g로 나타났다. 신초수는 모든 처리구에서 1개만 신장하는 것으로 나타났다(Table 1). 초장은 sucrose 3%에서 8.33cm로 가장 높았으며, sucrose 6%와 9%에서 4.83cm, 4.01cm로 나타났다. 뿌리수는 sucrose 3%에서 1.3개로 가장 높았으며, sucrose 6%와 9%에서 0.31개로 동일하게 나타났다. 최대근장은 sucrose 3%에서 2.39cm로 가장 높았으며, sucrose 6%와 9%에서 2.70cm, 1.70cm로 나타났다. 지금까지 대부분의 식물을 위해 고체배지에 3% 정도의 sucrose를 넣어 왔다. 본 실험의 결과 액체배지에서 프리지아의 부정아로부터 신초를 생육시키기 위해서는 3%의 sucrose가 적당하다는 것을 알 수 있었다. 그러나 적정 sucrose농도는 식물에 따라 조금씩은 달라질 수 있는데, 생강(Zingiber officinale)에서는 6% 농도에서 신초수가 가장 많아지고 신초의 생육도 가장 좋은 것으로 보고되었다(Ahn et al. 2007). 또한 나리 인편도 6 ~ 9% sucrose에서 가장 효과적으로 증식되었던 것으로 보고되었다(Eum et al. 2010).

액체진탕배양으로 프리지아 부정아를 4주 동안 신장시킨 후 배지의 pH와 EC의 변화를 분석한 결과, pH와 EC 모두 처리간에 유의적인 차이가 보이지 않았다. pH의 경우, 실험 시 작 직전에 5.8이었으나 4주 후에는 3.7 ~ 4.2 범위로 낮아진 것으로 나타났다. EC는 모든 처리구에서 0.36 ~ 0.39의 범위로 유의적인 차이가 보이지 않았다.

이러한 결과들을 종합해보면 프리지아 부정아를 이용하여 액체진탕배양으로 신초를 생장시키고자 할 때, MS 배지 농도는 1/2배가 좋으며, sucrose는 3%가 가장 효과적인 것으로 생 각된다.

액체진탕배양 시, sucrose, 온도, 광이 프리지아 구경 비대에 미치는 영향

액체진탕배양 시 온도가 프리지아의 구경 비대에 미치는 영향을 관찰한 결과, 구경의 생체중과 건물중 모두 17℃에서 1.16g과 0.37g으로 가장 높았으며, 다음이 22℃에서 생체중은 0.9g, 건물중은 0.28g이었다(Fig. 2). 고체배지(대조구)에서는 생체중 0.45g, 건물중은 0.21g 으로 구경의 생육이 가장 늦은 것으로 나타났다. 구경으로부터 자구의 발생은 17℃ 에서는 전혀 관찰되지 않았으나 22℃에서 구경당 자구수가 0.2개로 자구가 발생하는 것을 알 수 있었다. 고체배지(대조구, 17℃)에서는 자구수가 0.07개로 자구가 미미하게 발생되는 것으로 관찰되었다(Table 2). 구경의 직경은 17℃에서 11.03mm, 22℃에서 10.85mm로 유의적인 차이가 보이지 않았으나, 고체배지에서는 8.40mm로 액체진탕배양에서 보다 유의적으로 낮 은 것으로 나타났다. 구고는 22℃와 17℃에서 13.36mm와 12.09mm 로 구경 직경과 마찬가지로 유의적인 차이가 보이지 않았으나, 고체배지에서는 8.34mm로 액체진탕배양 보다 크게 낮은 것으로 나타나 구 비대가 늦은 것을 알 수 있었다. Eum et al.(2010)도 나리 인편을 액체진탕배양 시 고체배지보다 종에 따라 구비대가 최대 114 ~ 215% 촉진되었다고 하였다. 고체배지보다 액체배지에서 생육이 촉진되는 원인으로는 액체배지에서 식물호르몬이나 영양성분이 더 잘 흡수되고 이식체로부터 분비되는 생장억제물질이 액체배지에서는 쉽게 이동되어 농도가 낮아지기 때문인 것으로 보고되고 있다(George and Davies 2008; Preil 2005; Sivanandhan et al. 2013).

Sucrose농도가 구경 비대에 미치는 영향은 광 조건에 따라 다르게 나타났다(Fig. 3, 4, Table 3). 광 조건에서는 6 ~ 12% sucrose에서는 구경 생체중이 1.4g 정도로 비슷하였으나, 3%와 고체배지에서는 0.7g 이하로 크게 낮아졌다. 그러나 암조건에서는 sucrose 농도에 따라 생체중이 크게 달랐다 (Fig. 3A, C). Sucrose 9%에서 2.6g으로 생체중이 크게 높았던 반면, 12%에서는 1.8g, 6%와 12%에서는 약 0.8g으로 비슷하였다. 구 건물중에서도 생체중과 매우 비슷한 경향을 보였다. 광조건에서는 6%이상의 농도에서는 0.46 ~ 0.56g으로 비슷하였으며, 암조건에서는 9%에서 가장 높고, 그 다음은 12%, 그리고 15%와 6% 순이었다. 9% sucrose의 경우, 고체배지 보다 액체진탕배양에서 4배 이상 구경 비대가 빠른 것을 알 수 있었다. 구경의 직경은 광조건에서 9% 이상의 농도에서 11.2mm 이상으로 비슷하였으며, 6% 이하에서는 조금씩 감소하였다. 구고는 구경 생체중과 비슷한 경향을 보였다. 광조건에서보다 암조건에서 구고가 훨씬 높은 것으로 나타났으며, 특히 9% sucrose에서 구고가 23.44mm나 되었는데, 이는 고체배지의 구고보다 약 3배나 큰 수치였다. 그러나 그 이상의 농도에서는 구고가 현저하게 감소하였다.

Park et al.(2001)도 글라디올러스의 경우 고체배지보다 액체진탕배양에서 소구경의 크기가 훨씬 컸다고 보고 하였으며, Kim et al.(2003)과 Lian et al.(2003)은 생물배양기에서 나리를 배양했을 때, 9% sucrose가 첨가된 배지에서 구비대가 가장 효과적이었다고 하였다.

프리지아 구경을 기내에서 비대시킬 때 자구 발생 정도도 광 조건에 따라 크게 달라졌다(Table 3, Fig. 4). 광조건에서는 sucrose 농도 상관없이 모든 처리구에서 자구가 발생한 반면, 암조건에서는 자구 발생을 볼 수 없었다. 광조건에서의 자구 발생은 sucrose 농도가 6 ~ 9% 범위에서는 0.47 ~ 0.73개로 비슷한 수준이었으나 고농도인 12%에서는 0.27개로 감소하였다. 나리 ‘Casa Blanca’의 경우도 암배양보다 명배양에서 자구수가 많았다는 연구결과도 있어(Han et al. 1999), 자구가 없는 개화구를 기내에서 생산하고자 할 때는 암조건이 필수적인 것을 알 수 있었다.

실험 개시 6주 후 배지의 pH와 EC를 분석했을 때, pH는 광조건에 상관없이 sucrose 농도가 높을수록 높아지는 경향을 보였고, EC는 낮아지는 경향이 뚜렷하였다. 이러한 결과들을 종합해보면, 액체진탕배양으로 프리지아의 부정아로부터 신초를 증식시키는데는 1/2 배 MS 배지에 sucrose를 3% 첨가하는 것이 좋고, 구경을 비대시키기 위해서는 1/2배 MS배지에 sucrose를 9% 첨가하여 암조건에서 진탕배양하는 것이 가장 효율적인 것으로 생각된다.