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기공은 식물 잎의 표피에 분포하는 미세 구멍으로 단자엽식물에서는 주로 아령형(dumb-bell-shaped) 기공이 발견되며, 쌍자엽식물에서는 신장형(kidney-shaped) 기공의 형태가 주 로 관찰된다. 아령형 기공은 신장형 기공보다 공변세포의 작은 변화에도 기공개폐가 더 쉽게 조절되기 때문에 더 진화된 형태로 보고 있다(Wang et al. 2007). 특히, 난과 식물에서 기 공의 형태는 난을 분류하는 방법으로 이용될 수 있을 정도로 특이적이다(Paek and Jun 1995). 난과 식물 기공의 외부 길이는 매우 다양하며, 덴드로비움의 경우 14.6㎛에서 62.6㎛로 보고되었다(Yukawa et al. 1992). 기공의 모양도 원형, 좁은 층 모양, 뭉툭한 직사각형 모양 등 다양하며 형태적 특징으로 분류된다(Rasmussen 1987).
기공은 식물이 육상 환경에 적응하기 위해 만든 특수 기관이며, 기공을 통한 증산작용 과정에서 수분 손실을 조절하고 광합성을 위해 이산화탄소와 같은 가스가 교환된다(Haworth et al. 2015; Wang et al. 2007). 기공은 잎 표면에서 비록 3% 정도 차지하고 있지만, 기공을 통해 약 70% 이상의 증산이 일어난다고 한다(Öpik and Rolfe 2005). 또한 난대 산림지역에 서 일어나는 최대 증산율은 대기 중 수증기의 약 두 배 가량에 해당되고, 전지구적으로 약 17%의 대기가 기공을 통해 순환된다(Hetherington and Woodward 2003). 따라서 효과적인 기공개폐 조절은 광합성 기간 동안 수분 이용 효율을 최적화하고 수분 부족이 일어날 때에 식물 체내의 건조를 막기 위한 근본적인 역할을 하기 때문에 식물 생육에 직접적인 영향을 미친다(Wang et al. 2014).
식물 기공의 특징은 기공의 수와 크기, 기공밀도, 기공지수, 기공개도 등으로 표현된다. 이 중 기공개도는 기공의 열림 정도를 나타내는 것으로 식물의 수분과 이산화탄소 조절에 가장 즉각적인 반응을 나타낸다(Medina and Gilbert 2015). 기공개폐에 대한 연구는 기공의 움직임이 다양한 환경요인에 의해 어떻게 조절되는지 또는 수분이용효율을 향상시키기 위해 어 떻게 유전적으로 조절되는지 등에 대한 많은 연구가 수행되어 왔다(Hetherington and Wood ward 2003; Wang et al. 2007; Zelitch 1961). 기공의 개폐에 따라 민감하게 영향을 받는 식물 체내의 수분과 가스 교환은 식물의 수분 생리와 광합성 효율과 밀접하게 관련되어 있으며, 이는 식물의 생육과 직결된다(Nam et al. 1982). 기공개도를 나타내기 위해 다양한 방법이 이용되어 왔다. Sànchez et al.(2013)는 기공개도를 5단계로 구분하였으며, Doheny-Adams et al.(2012)은 타원면적 공식을 이용하여 산출된 기공의 면적을 기공개도로 나타냈다. Yan et al.(2012)은 기공의 면적이 기공의 밀도보다 기공전도도와 증산율에 정의 상관관계가 있다고 밝혔다. 기공의 너비도 기공개도를 나타내는 방법으로 이용된다(Thomas et al. 2003). Zelitch(1961)는 담배의 기공개폐 기준으로 2㎛의 기공 너비를 제시하였다. 이와 같이 기공이 완전히 닫힌 경우가 아닐지라도 기공이 닫힌 경우로 간주될 수 있다. 따라서 기공의 반응을 연구하기 위해서는 각 측정방법에 따른 기공개폐 기준설정이 필요하다.
CAM(crassulacean acid metabolism) 식물은 건조한 환경에 적응하여 고온인 낮에 기공을 닫아 수분 손실을 최소화하고 밤에 기공을 열어 이산화탄소를 흡수하여 체내에 저장하는 식 물이다(Caemmerer and Griffiths 2009). 최근 전세계적으로 대기 중의 이산화탄소 농도가 증가함에 따라 기후변화가 일어나면서 이산화탄소에 따른 식물의 반응에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다(Hwang and Jeong 2009). 식물 생장과 생리학적 반응에 대한 효과는 이산화탄소의 노출시간과 환경조건에 따라 다양하게 나타나지만 CAM 식물은 식물종에 따라서 상반된 결과들이 보고되었다(Croonenborghs et al. 2009). 광, 온도, 이산화탄소 농도와 같은 다양한 환경 조건은 기공개폐에 영향을 미치며, 식물의 수분이용효율에 직접적 영향을 미 치는 증산양의 경우, 닫힌 기공에 의해 열린 기공 대비 약 2 ~ 50%의 증산이 감소하게 된다(Öpik and Rolfe 2005). 따라서 다양한 환경 조건에 따라 달라지는 CAM 식물의 생리적 반 응에 대한 연구를 위해서는 CAM 식물에 대한 기공개도 연구가 선행되어야 한다고 생각한다. 본 연구에서는 기공 기작 연구에서 가장 많이 사용하는 방법인 세 가지 기공개도 측정(열린 기공 단계, 기공 면적과 너비) 방법을 선정하였으며, 절대적 CAM 식물의 하나인 호접란 Queen Beer ‘Mantefon’의 기공전도도 변화를 바탕으로 각 기공개도 측정 방법에 따른 기공개폐 기준을 제시하고자 하였다.
재료 및 방법
식물 재료 및 생육 조건
호접란 ‘Mantefon’ (Doritaenopsis Queen Beer ‘Mantefon’) 15개월 묘를 전문 난원(Kobong Orchid Farm, Gyeonggi, Korea)에서 구입하였다. 실험 시작 전 묘의 엽장, 엽폭, 엽수는 각각 약 11.3cm, 5.2cm, 4매였다. 피트모스(Klasmann, YVP Fertilizers Co., Ltd., Thailand), 수태(Lonquen Ltda., Puerto Montt, Chile), 바크(medium-grade Douglas fir bark, Klasmann-Deilmann GmbH, Geeste, Germany)를 각각 65:30:5 비율로 혼합한 배지를 12cm의 투명 플라스틱화분에 채운 다음 실험 묘를 이식하였다. 이식된 묘는 생장상(HB-303DHC, Hanbaek Scientific Technology, Korea)에서 7개월 동안 온도는 25/20℃(12/12시간), 12시간 광주기로 광도는 160μmol·m-2·s-1에서 재배되었다. 광원은 삼파장 형광등(Dulux L 36W, Osram, Korea)을 이용하였으며, 생장상 내의 습도는 50%로 유지하였다. 수분관리를 위해 토양수분센서(SM100, ENCOSYS, Korea)를 이용하여 센서의 수치가 약 0 ~ 5%를 가리켰을 때 양액(EC 0.8 ± 0.1mS·cm-1, pH 6.0 ~ 6.5; Newgold 20N-8.7P-16.7K, Neufarm Corp., Germany)을 충분히 두상관주하였다. 생장상 내부의 CO2 농도는 450ppm이었다.
기공 관찰 표본 제작
생육상에서 7개월 동안 재배된 호접란 ‘Mantefon’의 건전한 잎 뒷면 선단 부위에 투명 매니큐어(Shine top coat, Missha, Korea)를 바른 뒤 10 ~ 15분간 말리고 끝 부분을 테이프를 사 용하여 잎을 본 뜬 매니큐어 조각을 떼어내었다. 매니큐어 조각은 슬라이드 글라스에 고정시켜 광학현미경(YS100, Nicon, Japan)으로 관찰하고 사진 촬영을 하였다. 촬영된 사진은 영상분석 프로그램(ImageJ 1.43u, Wayne Rasband, USA)을 이용하여 분석되었다. 본 과정은 24시간 동안 2시간 간격으로 진행하였다.
기공의 수와 크기 측정
생육상에서 7개월 동안 재배된 호접란 ‘Mantefon’의 건전한 잎 뒷면 선단 부위 약 3.4mm2의 면적을 대상으로 기공의 수를 총 3회 조사하였다. 기공의 수는 광학현미경(YS100, Nicon, Japan) 100배율에서 조사되었으며, 단위면적 당 기공의 수로 환산하였다. 기공의 길이와 기공을 포함한 공변세포의 너비는 무작위로 선택된 총 60개의 기공을 광학현미경 (YS100, Nicon, Japan) 1000배율에서 관찰하여 평균을 구하였다. 기공의 수, 기공 길이와 기공을 포함한 공변세포의 너비는 야간인 04:00와 주간인 16:00에 조사되었다.
기공전도도 측정
생육상에서 7개월 동안 재배된 호접란 ‘Mantefon’을 무작위로 3개체를 선발하여 가장 위에 전개된 잎의 기공전도도를 측정하였다. 측정한 잎의 길이는 8.0 ~ 9.5cm이었으며, 너비 는 4.5 ~ 5.5cm이었다. 기공전도도 측정은 광합성측정기기(Li-6400, Licor, USA)를 이용하였으며, 24시간 동안 2시간 간격으로 3일동안 진행되었다.
열린 기공 단계에 따른 기공개폐 기준
잎 표본당 약 3.4mm2의 동일한 면적을 대상으로 3반복으로 관찰하였다. 기공의 특징은 열린 기공의 정도에 따라 열린 기공 유형과 닫힌 기공의 유형으로 분류하여 조사하였다. 측 정은 광학현미경(YS100, Nicon, Japan)의 100배율에서 진행되었다.
기공의 면적에 따른 기공개폐 기준
24시간 동안 2시간 간격으로 채취된 매니큐어 샘플에서 각 시간 별로 기공 20개를 무작위로 선택하였다. 광학현미경(YS100, Nicon, Japan) 1000배율에서 기공을 관찰하면서, 기 공의 너비(SW, stomatal width)와 길이(SL, stomatal length)를 측정하였다(Fig. 1A). 기공의 면적은 다음과 같은 식으로 산출하였다(Doheny-Adams et al. 2012).
기공의 너비에 따른 기공개폐 기준
‘기공 면적에 따른 기공개폐 기준’실험에서 측정한 기공을 제외하고, 24시간 동안 2시간 간격으로 채취된 매니큐어 샘플에서 무작위로 기공 20개를 선택하였다. 기공의 너비(SW, stomatal width)는 광학현미경(YS100, Nicon, Japan) 1000배율에서 측정하였다(Fig. 1A).
열린 기공 단계, 기공 면적, 기공 너비에 따른 열린 기공 비율
열린 기공 단계에 따른 열린 기공의 비율은 잎 뒷면 선단 부위 약 3.4mm2의 면적에서 현미경 100배율로 관찰한 뒤, 열린 기공의 기준에 맞춰 열린 기공의 수를 3반복으로 측정하여 그 평균으로 나타냈다. 기공 면적과 너비에 따른 열린 기공 비율은 각 측정 방법에서 관찰된 기공을 제외하고, 시간 별로 채취된 매니큐어 샘플에서 무작위로 기공 13개를 선택하여 각 열린 기공의 기준에 맞춰 열린 기공의 비율로 계산하였다.
통계처리
실험의 결과들은 평균과 표준오차로 표현하였으며, 통계적 유의성은 SAS version 9.2(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 Student’s t-test, 5% 유의수준에서 각 처리간의 유의성을 검증하였다.
결과 및 고찰
호접란 ‘Mantefon’의 기공은 뚜렷하게 관찰되었으며(Fig. 1B), 기공의 유형은 불규칙형 기공(anomocytic stomata)으로 분류되었다(Chen et al. 2001; Paek and Jun 1995). 난과에 속하는 Dendrobium winkaphyllum에서 관찰된 기공 모양과 유사하였다(Conran et al. 2009).
호접란 ‘Mantefon’ 잎 뒷면 선단 부위의 기공 수는 04:00와 16:00에 각각 1mm2 당 약 16.18, 15.98개로 관찰되었다(Table 1). 같은 면적으로 환산한 호접란 ‘Lipstick’ 잎의 중앙 부위의 기공 수는 약 28.4개, 기공을 포함한 공변세포의 너비는 27.2㎛로 호접란 ‘Mantefon’의 기공 수보다 많고 기공의 크기도 약간 큰 것으로 나타났다(Paek and Jun 1995). 호접란 ‘Mantefon’의 기공은 기공의 크기가 작아지게 되면 기공 수가 많아지는 일반적인 특징과 다르게 호접란 ‘Lipstick’보다 기공의 크기가 작음에도 불구하고 기공의 수는 적게 나타났다(Franks et al. 2012). 난과의 기공 모양은 다양한 것으로 알려져 있는데, 호접란 ‘Mantefon’은 주로 타원형과 일부 작은 원형이 관찰되었다. 기공의 길이는 시간에 따른 유의성은 발견되지 않았으며 약 11㎛ 내외로 Dendrobium에서 보고된 수치와 유사하였다(Yukawa et al. 1992).
광학현미경 1000배율로 기공을 확인할 경우, 좀 더 정확하게 기공개폐 여부를 판단할 수 있었으나, 배율이 높아짐에 따라 한 번에 관찰할 수 있는 기공의 수가 제한되었다. 따라서 기공개폐의 빠른 측정을 위한 기준을 설정하기 위해 광학현미경 100배율에서 관찰되는 기공의 열림 정도를 바탕으로 기공 개폐 기준을 Fig. 2와 같이 구분하였다. 대체적으로 열린 기공의 기준은 기공의 크기와 상관없이 공변세포 안쪽으로 타원형의 기공이 뚜렷하게 관찰되었으며, 닫힌 기공의 기준은 기공 부위에 거의 실선과 같은 모양이 관찰되었다(Fig. 2).
호접란 ‘Mantefon’의 기공전도도는 주간 12:00 ~ 18:00에 0㎛olH2O·m-2·s-1 이하의 값을 보이다가 18:00 이후로 값이 증가하였다(Fig. 3A). 야간이 시작되는 자정(00:00)에는 기공 전도도가 약 –0.001㎛olH2O·m-2·s-1를 나타났으며, 02:00 ~ 04:00에 0.006㎛olH2O·m-2·s-1까지 증가한 다음, 04:00 이후부터 기공전도도는 다시 급격하게 감소하였으며, 08:00에서 12:00까지 -0.003 ~ 0㎛olH2O·m-2·s-1의 범위를 나타냈다. 호접란 ‘Mantefon’의 기공전도도는 야간에 주로 기공을 열고 주간에 기공을 닫는 전형적인 CAM 식물의 특징을 반영하였 다(Caemmerer and Griffiths 2009).
기공 면적의 일변화를 살펴보면, 주간에는 14:00를 제외하고는 전반적으로 약 20μm2을 나타냈다(Fig. 3B). 기공 면적은 주간보다 야간에 높아졌으며, 주간에서 야간으로 바뀌는 22:00 ~ 00:00에 기공 면적이 약 52% 증가하였다. 야간이 시작되는 00:00에 약 35μm2으로 기공 면적의 최대값을 나타내다가 08:00에 점차 감소하는 경향을 보였다. 기공 면적의 일 변화는 야간에 기공이 열리고, 주간에 기공이 닫히는 CAM 식물의 특징이 관찰되었다. 기공전도도가 가장 높게 일어난 시간대인 02:00 ~ 06:00을 바탕으로 열린 기공의 면적 기준을 추정하면 대략 29μm2 이상이라고 판단된다.
기공 너비의 일변화는 기공 면적의 일변화와 전반적으로 비슷한 양상을 보였다(Fig. 3C). 주간에 기공 너비는 대략 1.9 ~ 2.6μm 범위를 나타냈으며, 야간이 시작되는 00:00에 기공의 너비는 약 71% 급증하였다. 06:00에 기공 너비가 최대로 열렸으며, 약 4μm 되었다. Arabidopsis의 기공 너비는 0 ~ 3μm 정도이며(Mishra et al. 2006), 소맥의 엽신의 기공 너비는 0.7 ~ 6.3μm, 감자에서는 최대 8μm까지 측정되었다고 보고되었다(Nam et al. 1982; Yan et al. 2012). 식물 종에 따라서 수치상의 차이는 존재하였지만, 기공개도는 공변세포의 확장에 의해서 결정되기 때문에 종에 따른 편차는 크지 않는 것으로 보인다. 기공전도도가 가장 높게 일어난 시간대인 02:00 ~ 06:00을 바탕으로 열린 기공의 너비 기준을 추정하면 대략 3.3μm 이상으로 판단된다. 이는 Zelitch(1961)가 담배의 닫힌 기공의 너비 기준을 약 1μm, 열린 기공의 너비 기준을 4μm로 제시한 것과 유사한 것으로 나타났다.
기공 면적과 너비에 따른 일변화는 기공전도도에 비해 비교적 변화폭이 작은 것으로 보인다(Fig. 3A-C). 이는 소맥 엽신의 기공의 일변화에서 선단부로 갈수록 변화양상이 작아진 것 과 같이 호접란 ‘Mantefon’의 경우도 같은 잎에서 위치에 따라 기공의 변화에 차이가 있을 것으로 판단된다(Nam et al. 1982).
각 측정방법에 따른 열린 기공의 비율을 살펴본 결과, Fig. 2와 같이 열린 기공 단계에 따라 열린 기공 기준을 적용할 경우, 측정 방법이 다른 방법보다 비교적 간단하고 소요시간이 적게 걸리는 장점이 있었다. 그러나 기공전도도의 일변화의 경향과는 다르게 밤에 기공이 열리고 낮에 기공이 닫히는 CAM식물의 특성이 잘 반영되지 않았으며, 열린 기공의 비율은 주야간의 유의한 차이를 찾을 수 없었다(Fig. 3A, D). 이는 관찰한 샘플에 따라 현미경 내에서 보여지는 기공 형태가 다르게 보여 기공개폐의 여부가 잘못 반영되었기 때문이라고 생 각된다. 특히 관찰되는 기공의 열림 정도에 따라 기공개폐 기준을 설정하였기 때문에 관찰자의 주관적인 관점이 개입될 가능성이 높아 샘플 간의 오차범위도 크게 나타난 것으로 생각된다. 호접란 ‘Mantefon’ 잎의 기공 면적과 너비에 따른 열린 기공의 일변화는 전반적으로 야간에 열린 기공의 비율이 주간보다 높았으며, 02:00 ~ 06:00에 열린 기공의 비율이 가장 높은 것으로 나타났다(Fig. 3D). 기공 면적과 너비에 따른 열린 기공의 일변화는 비교적 비슷한 경향을 보였다. 이는 기공의 길이가 비교적 일정하여(Table 1), 기공의 면적은 기공 너비에 비례하기 때문이라고 생각된다(Fig. 3B, C).
이상의 결과를 종합해 볼 때, CAM 식물인 호접란 ‘Mantefon’에서 세 가지 기공개도 측정 방법 중 기공전도도 일변화의 경향을 가장 잘 반영한 것은 기공의 면적과 너비를 기준으로 하 는 방법이었으며, 이 때 열린 기공의 기준은 기공 면적 약 29μm2 이상, 기공 너비 약 3.3μm 이상으로 확인되었다.
