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ISSN : 1225-5009(Print)
ISSN : 2287-772X(Online)
Flower Research Journal Vol.23 No.3 pp.161-166
DOI : https://doi.org/10.11623/frj.2015.23.3.26

In vitro Rapid Mass Propagation by Inverted Planting of Corm Explant in Domestic Breeding Freesia
국내 육성 프리지아 구경 절편체의 역위 치상에 의한 기내 급속대량증식

Mi Young Lim1, Ji Su Kang2, Youn Jung Choi2, Hyang Young Joung3, Jae Gill Yun1,2*
1Department of Horticulture Science, Gyeongnam National University of Science and Technology, Jinju 660-758, Korea
2Graduate, Gyeongnam National University of Science and Technology, Jinju 660-758, Korea
3Floriculture Research Division, National Institute of Horticultural & Herbal Science, Wanju 565-852, Korea

임미영1·강지수2·정향영3·최윤정3·윤재길1,2*
1국립경남과학기술대학교 원예학과
2국립경남과학기술대학교 대학원
3국립원예특작과학원 화훼과
*Corresponding author: Jae Gill Yun, Tel: +82-55-751-3252, E-mail: gyun@gntech.ac.kr
August 5, 2015 September 2, 2015 September 15, 2015

Abstract

Quality reduction due to virus infection often occurs in domestically propagated freesia plants. To produce high quality freesia continuously, virus free corms should be induced, propagated, and distributed massively in a short period. Present study was conducted to determine an efficient protocol for in vitro mass propagation of corms using corm explant of two freesia cultivars bred in Korea, ‘Shiny Gold’ and ‘Gold Rich’. MS medium was used for this experiment as basal medium, and 5.0 mg • L−1 NAA and 5.0 mg • L−1 kinetin were added in the medium, to investigate the effect of plant hormones on the induction of callus or adventitious bud formation. Freesia corms were cut horizontally in 3-4 mm thickness and planted on the media at normal position or inverted position. The explants were placed in dark condition for 5 weeks, then transferred to light condition (60 μmol • m−2 • s−1, 16/8, day/night). At 10 weeks after planting, the explants planted at inverted position showed 2-6 times higher values in adventitious buds occurrence regardless of cultivar or plant hormone. At 19 weeks after planting, the explants of ‘Shiny Gold’ planted at inverted position showed 42.7 shoots per explant in the basal medium and 17.7 shoots in the hormone added medium, demonstrating 2-7 times higher values than those planted at normal position. The explants of ‘Gold Rich’ planted at inverted position showed 55.4 shoots per explant in the basal medium and 61 shoots in the hormone added medium, demonstrating 1.7-2.4 times higher values than those planted at normal position. In conclusion, planting explants from horizontally cut corm at inverted position on medium could be an efficient method for mass propagation of two freesia cultivars bred in Korea.


국내 육성 프리지아(Freesia)가 농가에 보급되고 시간 이 지나면서 바이러스에 감염되거나 품질이 저하되는 문 제가 발생하고 있다. 고품질을 유지하기 위해서는 생장 점 배양을 통해 무병종구를 만들고 기내에서 급속 대량 증식하여 농가에 보급하는 일이 시급하다. 본 연구에서는 국내에서 육성된 프리지아 ‘Shiny Gold’와 ‘Gold Rich’의 자구를 이용하여 효과적인 급속 대량증식 기술을 찾고자 실험을 수행하였다. 배지는 MS기본배지에 호르몬을 첨가 하지 않은 배지와 5.0mg • L−1 NAA + 5.0mg • L−1 Kinetin 를 넣은 호르몬배지 2종류를 이용하였다. 치상방법은 자 구를 횡으로 절단한 절편체를 정상으로 치상(정상치상)한 경우와 위아래를 거꾸로 치상(역위치상)하는 2가지 방법 을 이용하였다. 치상한 절편체는 23oC의 암배양실에서 5 주간 배양한 후, 광도 60μmol • m−2s−1 (16/8, 주/야)의 광 환경으로 옮겨 주었다. 치상 10주째에 두 품종 모두 역 위치상하였을 때, 정상치상에 비해 부정아 발생이 2 ~ 6 배 정도 증가하였다. 이러한 결과는 호르몬 유무에 상관 없이 비슷한 결과를 보였다. 역위치상하고 19주 후 ‘Shiny Gold’의 신초수는 기본배지에서 절편체당 42.7개로 정상 치상에 비해 약 2.5배 증가되었고, 호르몬 첨가배지에서 는 17.7개로 정상치상에 비해 약 7.1배 증가되었다. ‘Gold Rich’를 역위치상 하였을 때, 기본배지에서는 신초수가 절 편체당 55.4개로 대조구에 비해 약 1.7배 증가되었고, 호 르몬 첨가배지에서는 61.0개로 대조구에 비해 약 2.4배 증가되었다. 결론적으로 프리지아 자구를 기내에서 급속 대량증식 하고자 할 때, 호르몬 유무와 상관없이 자구를 횡으로 절단하여 역위치상 하는 방법이 효율적이라는 것 을 알 수 있었다.


초록


    Rural Development Administration
    PJ010080

    서 언

    프리지아(Freesia hybrida)는 붓꽃과 프리지아속에 속하 며 남아프리카 원산의 구근화훼식물로, 다양한 화색과 은 은한 향기로 국내외에서 절화 및 분화로 많이 사용하고 있다(Cho et al. 2015; Wang 2006). 프리지아 구근은 변 형된 줄기가 비대하여 형성된 원추형의 인피구경으로 우 리나라에서는 11월부터 다음해 4월말까지 전국에서 재배 및 유통되는 대표적인 겨울 화종이다(Cho et al. 2011). 과거 국내 절화용 프리지아는 네덜란드에서 육성된 반겹 꽃 ‘Yvonne’ 품종이 많이 점유하고 있었으나, 구근을 전 량 수입해야 했기 때문에 생산비에서 구근 구입비 비중 이 매우 크게 차지하였다(Cho et al. 2011; Kim et al. 1997). 그러나 국립원예특작과학원에서 1999년부터 다양 한 품종을 육성하고자 노력한 결과 2003년 황색 겹꽃 ‘Shiny Gold’를 시작으로 다양한 화색의 국산 품종이 개 발되어 국내외 시장에서 호평을 받기 시작하였다(Cho et al. 2011). 2013년 국산 품종의 보급률은 38%에 달하고 있으며 수출도 2012년 100만본을 달성하여 농가소득을 높 이고 있다(Cho 2007; Cho et al. 2015). 그러나 국내 육성 품종이 보급되고 7, 8년이 지나자 품질과 수량이 감 소되는 문제가 발생되고 있다(Ko et al. 2003). 고품질의 프리지아를 지속적으로 생산하기 위해서는 바이러스에 감 염되지 않은 무병구를 사용하는 것이 필수적이다(Foxe 1993; Kim et al. 1997). 바이러스에 감염되어 있는 식 물체로부터 무병구를 생산하기 위해서는 정단부에 있는 생장점을 따서 기내에서 유식물체를 얻는 방법이 많이 이 용되고 있다(Kim et al. 1997; Ko et al. 2003). 이렇게 얻어진 유식물체는 조직배양기술을 이용하여 기내에서 급 속 대량증식하고 순화시켜서 무병 건전묘를 생산하는데 이용된다(Liu and Burger 1986). 이런 과정에서 유식물 체 또는 부정아를 짧은 기간에 많이 발생시키는 기술이 무엇보다도 중요하게 된다.

    조직배양시 부정아 발생 정도는 절편체 종류, 생장조 절제, sucrose 농도 및 광주기 등 다양한 요인에 의해 영 향을 받는다(Han and Kim 2009; Lim et al. 2005; Nam et al. 2005; Park et al. 2005). 프리지아의 조직 배양에 관한 연구에서 대량증식을 위한 적정 호르몬(Ko et al. 2003)과 무기염류와 생장조절 물질(Kim et al. 1997)에 관한 연구 결과가 보고 되었다. 하지만 지금까 지 구경 절편체를 어떻게 치상했을 때 부정아 발생 효 율이 높은가에 대한 연구는 전무한 실정이다. 국화에서 부정아 유도시 마디를 수직으로 또는 수평으로 치상하는 방법에 따라서 부정아 유기가 달라졌으며(Lim et al. 2005), 복숭아 조직배양 시 신초 정단분열조직을 제거하 고 수평으로 치상하는 경우가 신초의 정단분열조직을 그 대로 두고 수평으로 치상하거나 수직으로 치상하는 경우 보다 신초 증식에 더 효과적이라는 보고가 있었다(Jun et al. 1998; Yae et al. 1987). 이와 같이 절편체를 어떻게 치상하느냐에 따라 캘루스나 부정아 발생이 크게 달라질 수 있다.

    본 연구에서는 국내에서 육성된 프리지아의 좀 더 효 율적인 기내 급속대량 증식기술을 찾기 위한 목적으로 실 험을 수행하던 중 구경 절편체를 상하 거꾸로 배지에 치 상하였을 때, 부정아와 신초 발생이 획기적으로 증가하 는 것을 알게 되었기에 보고하고자 한다. 동시에 절편체 치상방법을 달리 했을 때 호르몬의 유무가 부정아와 신 초 발생 정도에 미치는 영향도 관찰하였다.

    재료 및 방법

    식물재료

    국립원예특작과학원 화훼과에서 육성된 프리지아 ‘Shiny Gold’와 ‘Gold Rich’ 두 품종을 이용하였다. 하늘화훼종 묘로부터 프리지아 구경(직경 1 ± 0.2cm)을 품종별로 분 양 받아 사용하였으며 실험에 이용하기 위해서 소독을 실 시하였다. 70% 에탄올에 3분간 처리하고 Tween 20을 첨 가한 2% NaOCl에 20분 동안 처리하였다. 매 처리마다 멸균수로 구경을 3회 정도 세척하였다. 소독이 끝나고 멸 균된 filter paper에서 건조시킨 후 1/2 MS배지(호르몬 무첨가)에 치상하고 23℃ 배양실에서 암 상태로 배양하 였다. 10일 경과 후 오염이 발생하지 않은 건전한 구경 을 선발하여 실험에 사용하였다.

    호르몬 처리와 치상 방법

    배지는 MS 기본배지만 이용한 대조구와 MS배지에 5.0mg • L−1 NAA + 5.0mg • L−1 Kinetin 을 첨가한 호르몬 배지로 하여 비교하였다. 기본배지에는 3% sucrose(w/v) 와 0.1%(w/v) 활성탄을 첨가하였다. pH를 5.8로 조절한 후 agar를 0.8%(w/v) 첨가하고 전자랜지를 이용하여 agar 를 완전히 용해시켰다. Agar가 완전히 용해된 배지는 페 트리디쉬(100 × 40mm)에 50mL씩 분주하고 고압멸균기를 이용하여 121℃에서 15분간 소독하였다.

    구경 절편체의 치상 방법을 달리하기 위하여 구경을 횡 으로 3-4mm 두께로 절단하여 상부가 위로 가도록 치상 한 처리구(정상치상)와 절편체를 뒤집어서 하부가 위로 가 도록 치상한 처리구(역위치상)를 두었다. 치상이 끝난 페 트리디쉬는 23℃의 배양실에서 암막을 이용하여 5주간 암 배양 한 후, 암막을 걷어주어 광도 60μmol • m−2 • s−1, 광주 기 16시간의 광환경으로 옮겨 주었다. 치상 후 10주째에 절편체에서 발생된 캘루스와 부정아를 나누어 계대배양하 였다. 호르몬이 없는 기본배지 처리구는 호르몬 없는 MS 배지에, 호르몬 배지의 것은 1.0mg • L−1BA + 0.5mg • L−1 IAA가 첨가된 MS배지로 계대배양하였다.

    생육조사

    치상 개시 후 10주째에는 부정아 발생 정도와 뿌리수 를 조사하였다. 부정아 발생정도는 0단계부터 5단계까지 6 수준으로 구분하여 조사하였다. 절편체의 절단면에 부정 아가 전혀 보이지 않을 때는 0, 절단면에 부정아 조직 크 기가 직경 1 ~ 2mm 일때는 1, 부정아 조직 크기가 직경 3 ~ 4mm 정도일 때는 2, 5 ~ 6mm 크기일 때는 3, 7 ~ 8mm 일 때는 4, 절단면 전면에 부정아가 발생하였을 때는 5로 간주하였다. 19주째에는 신초수와 신초의 초장, 생체중, 건 물중 등을 조사하여 처리간 차이를 비교분석하였다.

    실험설계 및 통계처리

    모든 처리구는 패트리디쉬당 3개의 절편체를 이용하였 으며, 각 패트리디쉬를 1반복으로 보고 각각 5반복 처리를 하였다. 이렇게 얻어진 데이터들은 SAS(Statistical Analysis System, V. 9.1, Cary, NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 ANOVA 검정과 Duncan’s multiple range test를 이용하여 실험군 평균값을 유의수준 5%에서 유의성을 검정하였다.

    결 과

    프리지아 ‘Shiny Gold’와 ‘Gold Rich’ 구경 절편체를 호르몬 유무, 치상방법을 달리하여 치상하고 암배양이 끝 난 5주째에 그 결과를 육안으로 관찰하였다. 호르몬 유 무와 관계없이 프리지아 구경 절편체를 역위치상했을 때 정상 치상한 처리구보다 노란색의 부정아와 뿌리가 훨씬 많이 관찰되었다(데이터 생략). 암상태에 있던 절편체들 을 광상태의 배양실로 옮기고 5주 후 1차 생육조사를 실 시한 결과, 암상태에서는 노란색이었던 부정아는 광상태 로 이동 후 녹색으로 변화되었으며 일부는 이미 신초로 성장하기 시작하였다(Fig. 1). 프리지아 ‘Shiny Gold’와 ‘Gold Rich’ 두 품종 모두 호르몬 유무에 따른 부정아 발생 정도에는 차이가 없었다. 그러나 절편체 치상을 정 상으로, 또는 거꾸로 역위치상을 하는 치상방법에 따라 서는 신초 발생정도와 뿌리수에서 높은 유의성을 나타내 었다(Table 1, Table 2). 호르몬이 없는 기본배지에서 부정아 발생 정도를 살펴보면 역위치상했을 때 ‘Shiny Gold’는 3.2개, ‘Gold Rich’는 4.3개로 정상치상했을 때의 약 2~6배 높은 결과를 보였다. 또한 ‘Gold Rich’ 품종이 ‘Shiny Gold’ 품종보다 부정아 발생과 뿌리수가 더 많은 것으로 나타나 품종간 차이를 보였다. 그리고 호르몬처리 에 따른 차이는 5.0mg • L−1 NAA + 5.0mg • L−1 Kinetin이 첨가된 배지에서 배양된 절편체가 기본배지에서 보다 뿌 리수가 더 많이 관찰되었다.

    처음 치상하고 19주가 지났을 때, 부정아에서 발달된 신초와 뿌리의 최종 생육을 조사하였다. 그 결과 ‘Shiny Gold’와 ‘Gold Rich’ 두 품종 모두 역위치상 했을 때, 호 르몬 유무와 상관없이 신초수가 매우 높게 나타났다(Fig. 2, 3). ‘Shiny Gold’ 절편체를 역위치상 하였을 때, 호르 몬 없는 MS배지에서 신초수가 절편체당 42.7개로 정상치 상에 비해 약 2.5배 증가되었고, 호르몬 첨가배지에서는 17.7개로 정상치상 처리구에 비해 약 7.1배 증가되었다. ‘Gold Rich’를 역위치상 하였을 때, 기본배지에서는 신 초수가 절편체당 55.4개로 정상치상에 비해 약 1.7배 증 가되었고, 호르몬 첨가배지에서는 61.0개로 정상치상에 비 해 약 2.4배 증가되었다. 호르몬 첨가가 신초 발생에 미 치는 영향에 대해서는 품종에 따라 차이가 있는 것으로 나타났다. ‘Shiny Gold’에서는 호르몬이 없을 때 호르몬 첨가 시보다 신초발생이 좋았으나, ‘Gold Rich’에서는 차 이가 보이지 않았다. 신초의 초장과 최대 근장의 경우 ‘Shiny Gold’와 ‘Gold Rich’ 두 품종 모두 식물호르몬이 첨가된 배지에서 정상치상했을 때 높은 경향을 보였다. 이는 신초수 발생정도와는 반대되는 결과로, 신초수가 적 을수록 신초의 생육은 상대적으로 좋았기 때문인 것으로 여겨진다. 생체중과 건물중의 변화는 ‘Shiny Gold’의 경 우 기본배지에 역위치상한 경우 생체중과 건물중이 유의 적으로 높게 나타났다(Table 3). 그에 반해 ‘Gold Rich’ 는 생체중에서는 차이가 없고 건물중은 호르몬 없는 배 지에 정상치상했을 때, 다른 처리구보다 유의적으로 낮 았다(Table 4).

    고 찰

    본 실험에서는 프리지아 구경을 횡으로 상중하 3부위 로 절단하여 배지위에 정상으로 또는 상하를 거꾸로 뒤 집어 치상하였다. 치상 후 5주간 암상태로 배양한 결과, 황색의 많은 부정아와 캘루스를 관찰할 수 있었다. 프리 지아 구경 조직배양시 배양초기에 일정기간 암배양이 요 구되며 기관분화는 광을 조사한 이후에 가능하다는 기존 결과(Kim et al. 1997; Stimart and Ascher 1982)와 같 은 결과를 관찰할 수 있었다. 광조건으로 옮기자 황색의 캘루스와 부정아들은 곧 녹색을 띄기 시작했으며, 부정 아와 신초가 신장하기 시작하였다(Fig. 1). 특히 절편체 를 역위치상했을 때는 정상치상했을 때보다 2.5배에서 7 배에 가깝게 많은 부정아 및 신초가 발생하였다(Fig. 3). 치상 19주 후에 1개의 절편체로부터 ‘Shiny Gold’는 40 개 이상의 신초를, ‘Gold Rich’의 경우는 60개 이상의 신초를 얻을 수 있었다. 이러한 결과는 지금까지 발표되 었던 프리지아 기내 급속대량증식에 관한 어떤 결과보다 도 효율적인 결과로 보인다. 부정아나 캘루스가 발생하 는 부위에 관해서는 정상치상의 경우에는 구경 표피에 있 는 액아로부터 많이 발생하였으나, 역위치상한 경우에는 절단면 전면으로부터 부정아와 캘루스가 발생하는 것을 관찰 할 수 있었다. 지금까지 구근류의 조직배양시 구근 을 횡으로 절단하여 상하를 반대로 치상한 연구결과가 보 고된 바 없다. 그렇기 때문에 어떤 기작에 의해 이런 결 과가 나왔는지 아직까지는 분명하게 설명하는데는 무리 가 있다. 다만 몇 종류의 식물에서 삽수를 정상으로 치 상하는 것 보다 수평이나 거꾸로 치상했을 때, 더 많은 신초가 발생하였다는 보고는 있다. 나리에서는 소화경을 조직배양할 때, 꽃받침에서 가까울수록 그리고 배지에 역 위치상했을 때, 정상치상보다 약 5배 정도 더 많은 부 정아를 발생시켰다는 보고(Liu and Burger 1986)가 있다. Orlikowska et al.(2000)은 크로톤(Codiaeum variegatum) 절편체를 역위치상했을 때, 그렇지 않은 경우보다 부정아 가 많이 발생하였다고 하였고 그 원인에 대해서는 오옥 신의 이동이 저해되었기 때문이라고 해석하였다. Kumar et al.(2005)은 고추(Capsicum annuum)의 하배축을 배지 에 역위치상했을 때에만 다수의 부정아를 얻을 수 있었 으며, 그 주된 원인으로는 극성이 관여하는 것 같다고 고 찰하였다. 본 연구 결과도 구경의 절편을 역위치상했을 때 정상치상보다 훨씬 많은 수의 부정아를 얻었지만 이 러한 현상이 선행 연구결과들과 같이 오옥신의 이동이나 극성과 관련이 있다고 판단하기는 곤란하며 금후 이에 대 한 좀더 세밀한 연구가 필요하다.

    그 동안 프리지아의 조직배양에 관한 연구로는 생장점 배양에 의한 무병주 생산에 관한 연구가 많이 있었고 (Bertaccini et al. 1989; Foxe 1993; Kim et al. 2013; Ko et al. 2003; Song 1998), 구경을 이용한 기내 대량증식 에 관한 연구도 있었다(Bajaj and Pierik 1974). 하지만, 구 경을 횡으로 잘라 절편을 역위치상했을 때, 부정아와 신 초 발생이 획기적으로 증가한다는 것은 본 논문이 최초 일 것이다. 결론적으로 프리지아를 기내에서 급속대량증 식을 하고자 할 때는 구경을 횡으로 절단하여 상하를 반 대로 뒤집어서 치상하는 것이 부정아 발생과 신초 발생 에서 가장 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 판단된다.

    Figure

    FRJ-23-161_F1.gif

    Adventitious buds and shoots induced from corm explants at normal position or inverted position in Freesia ‘Shiny Gold’ and ‘Gold Rich’ after 10 weeks of in vitro cultivation.

    FRJ-23-161_F2.gif

    Effect of normal or inverted planting on the number of shoots of Freesia ‘Shiny Gold’ (A) and ‘Gold Rich’ (B) after 19 weeks of in vitro cultivation.

    FRJ-23-161_F3.gif

    Effect of normal or inverted planting on the growth of Freesia ‘Shiny Gold’ (A) and ‘Gold Rich’ (B) after 19 weeks of in vitro cultivation.

    Table

    Effect of normal or inverted planting of corm explant on adventitious bud and root induction in Freesia ‘Shiny Gold’ after 10 weeks of in vitro cultivation.

    zAdventitious bud formation grade: 1 ~ 5.
    yMean separation within columns by Duncan’s multiple range test at P = 0.05.
    NS: Nonsignificant or significant at P ≤ 0.05, or 0.001, respectively.
    *: Nonsignificant or significant at P ≤ 0.05, or 0.001, respectively.
    ***: Nonsignificant or significant at P ≤ 0.05, or 0.001, respectively.

    Effect of normal or inverted planting of corm explant on adventitious bud and root induction in Freesia ‘Gold Rich’ after 10 weeks of in vitro cultivation.

    zAdventitious bud formation grade: 1 ~ 5.
    yMean separation within columns by Duncan’s multiple range test at P = 0.05.
    NS: Nonsignificant or significant at P ≤ 0.001, respectively.
    ***: Nonsignificant or significant at P ≤ 0.001, respectively.

    Effect of normal or reverse planting of corm explant on the growth of shoot and root in Freesia ‘Shiny Gold’ after 19 weeks of in vitro cultivation.

    zMean separation within columns by Duncan’s multiple range test at P = 0.05.
    NS: Nonsignificant or significant at P ≤ 0.05, or 0.01, respectively.
    *: Nonsignificant or significant at P ≤ 0.05, or 0.01, respectively.
    **: Nonsignificant or significant at P ≤ 0.05, or 0.01, respectively.

    Effect of normal or reverse planting of corm explant on the growth of shoot and root in Freesia ‘Gold Rich’ after after 19 weeks of in vitro cultivation.

    zMean separation within columns by Duncan’s multiple range test at P = 0.05.
    NS: Nonsignificant or significant at P ≤ 0.05, or 0.01, respectively.
    *: Nonsignificant or significant at P ≤ 0.05, or 0.01, respectively.
    **: Nonsignificant or significant at P ≤ 0.05, or 0.01, respectively.

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    2. Journal Abbreviation : 'Flower Res. J.'
      Frequency : Quarterly
      Doi Prefix : 10.11623/frj.
      ISSN : 1225-5009 (Print) / 2287-772X (Online)
      Year of Launching : 1991
      Publisher : The Korean Society for Floricultural Science
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